肝再生增強因子對多發(fā)性骨髓瘤細胞增殖的影響及其機制研究.pdf

1、背景:多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種來源于漿細胞的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，它的發(fā)生率在血液系統(tǒng)腫瘤中居第二位。MM的發(fā)病機制尚不清楚，目前骨髓微環(huán)境中細胞因子與骨髓瘤生長的關(guān)系是研究的熱點，已發(fā)現(xiàn)白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子(TNF)、肝細胞生長因子(HGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、白細胞介素-10(IL-10)、白細胞介素-21(IL-21)等細胞因子在骨髓瘤細胞的增殖、抗凋亡和耐藥性產(chǎn)生等

2、方面起了很重要的作用，它們通過作用于特異的受體再活化JAK/STAT3、PI-3激酶/AKT、Ras/MAPK、NF-κ B、β-catenin旁路等幾種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致骨髓瘤細胞增殖。
　　我們課題組在利用BALB/c小鼠的骨髓瘤細胞SP2/0和受免疫BALB/c小鼠的B淋巴細胞融合而成的雜交瘤細胞制備抗人肝再生增強因子(Augmenter of Liver Regeneration，ALR)單抗時偶然發(fā)現(xiàn):將能產(chǎn)生抗人ALR

3、單抗的雜交瘤細胞注射入BALB/c小鼠腹腔內(nèi)，從而產(chǎn)生含高濃度抗人ALR單抗的腹水，我們進行了多次制備，每次五只小鼠，然而讓人驚奇的是，每次總有2-3只小鼠在產(chǎn)生1-2輪腹水后，腹水自行消失，開腹檢查找不到任何接種雜交瘤細胞的痕跡。由此我們推測，骨髓瘤細胞可能產(chǎn)生和分泌大量ALR，并且嚴(yán)重依賴ALR來維持其惡性生長，由于小鼠的B淋巴細胞產(chǎn)生的抗人ALR單抗中和了骨髓瘤細胞增殖依賴的ALR，導(dǎo)致骨髓瘤細胞缺乏維持其惡性生長的刺激信號而發(fā)生

4、凋亡，最終腹水自行消失。
　　肝再生增強因子是上世紀(jì)90年代初被克隆的一種新的熱穩(wěn)定性、非特異性促進損傷肝臟修復(fù)的細胞因子，分子量約為15KD，其氨基酸序列和分子結(jié)構(gòu)均不同于肝細胞生長因子(HGF)，它在體內(nèi)多種組織器官中有表達。目前對它的生物學(xué)作用研究主要局限于肝臟。我們課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)，ALR在體外能刺激肝癌細胞的增殖，且其促增殖效應(yīng)與ALR的濃度成正相關(guān)，但是ALR對原代肝細胞的增殖無刺激作用。實驗證明ALR在肝癌組織中是

5、高表達的，而正常成人大多數(shù)肝細胞均不表達ALR，這些都提示ALR在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中起了重要作用。我們課題組最新的研究（基金資助項目:30570826）也證明用ALR特異性單抗阻斷肝癌細胞分泌的ALR與其受體結(jié)合或用siRNA在轉(zhuǎn)錄水平阻止ALR表達，均能明顯抑制肝癌細胞增殖和移植瘤的生長。
　　關(guān)于ALR在多發(fā)性骨髓瘤中的表達及其在多發(fā)性骨髓瘤增殖中的作用，目前國內(nèi)外尚無任何研究報道。因此，我們以此為切入點，針對以上ALR是否參

6、與多發(fā)性骨髓瘤發(fā)生、發(fā)展的作用進行研究，以期闡明ALR在多發(fā)性骨髓瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用和機制，并為多發(fā)性骨髓瘤的治療提供新的參考靶點和實驗依據(jù)。
　　本研究主要分為三個部分:
　　第一部分:ALR在人多發(fā)性骨髓瘤細胞株U266中的表達研究。
　　目的:通過對人多發(fā)性骨髓瘤細胞株U266中ALR的mRNA和蛋白水平的檢測，證明多發(fā)性骨髓瘤細胞高表達ALR，為進一步探討ALR在多發(fā)性骨髓瘤細胞增殖中的作用奠定基礎(chǔ)。

7、　　方法:利用Realtime PCR檢測人多發(fā)性骨髓瘤細胞株U266、小鼠骨髓瘤細胞株SP2/0及正常人外周血單個核細胞PMBC中ALR的mRNA表達水平;利用Western-blot檢測U266、SP2/0及PMBC細胞中ALR的蛋白表達水平。
　　結(jié)果:Realtime PCR結(jié)果顯示人多發(fā)性骨髓瘤細胞株U266和小鼠骨髓瘤細胞株SP2/0中ALR的mRNA表達水平明顯高于正常人外周血單個核細胞PMBC。Western-bl

8、ot結(jié)果顯示U266、SP2/0細胞株中ALR蛋白表達水平較高，而PMBC組未見ALR蛋白表達。
　　結(jié)論:在多發(fā)性骨髓瘤細胞株U266中，ALR mRNA及蛋白水平均為高表達。
　　第二部分:ALR對人多發(fā)性骨髓瘤細胞株U266增殖及凋亡的影響研究。
　　目的:檢測外源性加入ALR及抗ALR單克隆抗體后U266細胞增殖情況;構(gòu)建表達ALR基因的shRNA干擾慢病毒，檢測沉默內(nèi)源性ALR后U266細胞增殖及凋亡情況。<

9、br>　　方法:利用臺盼藍染色初步觀察U266細胞株在分別加入外源性ALR和ALR單克隆抗體后的增殖情況，然后利用MTS法檢測不同濃度的ALR和ALR單抗對U266細胞株增殖的影響。接下來，構(gòu)建表達ALR shRNA干擾慢病毒，感染U266細胞株，在熒光顯微鏡下通過綠色熒光蛋白(GFP)觀察感染效率，Real-time PCR檢測U266細胞株ALR mRNA水平，Western blot檢測U266細胞株ALR蛋白水平，觀察干擾效率。

10、通過臺盼藍排斥實驗、MTS法、Brdu滲入實驗檢測表達ALR shRNA慢病毒干擾ALR表達對U266增殖的影響。最后，通過流式細胞計數(shù)檢測U266細胞凋亡情況，Realtime PCR檢測凋亡相關(guān)因子P53、Bax、Bcl-2、survivin變化情況。
　　結(jié)果:
　　1、臺盼藍染色、MTS實驗結(jié)果顯示外源性加入ALR能促進U266細胞的增殖，且具有一定范圍內(nèi)的濃度一效應(yīng)關(guān)系，外源性加入抗ALR單克隆抗體能夠抑制U266

11、細胞的增殖。
　　2、成功構(gòu)建了表達ALR shRNA干擾慢病毒，熒光顯微鏡顯示shRNA干擾慢病毒能順利感染U266細胞株，其MOI值為1時，感染效率達80％。
　　3、Real-time PCR檢測表達ALR shRNA慢病毒感染U266細胞株72h后ALR mRNA水平明顯降低，約為對照shRNA慢病毒組的20％左右;Western blot檢測表達ALR shRNA慢病毒感染U266細胞株72h后ALR蛋白水平明顯降

12、低。
　　4、臺盼藍染色、MTS法、Brdu滲入實驗均顯示表達ALR shRNA慢病毒感染U266細胞株72h后，細胞增殖明顯受抑，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5、流式細胞儀檢測結(jié)果顯示表達ALR shRNA慢病毒感染U266細胞株72h后細胞凋亡明顯上升，Realtime PCR顯示凋亡相關(guān)因子Bax明顯上調(diào)，而Bcl-2明顯下調(diào)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、外源

13、性ALR能夠促進人多發(fā)性骨髓瘤細胞株U266的增殖。
　　2、外源性中和U266細胞自分泌的ALR，能夠抑制U266細胞的增殖。
　　3、表達ALR shRNA干擾慢病毒能夠內(nèi)源性沉默ALR的表達。
　　4、內(nèi)源性沉默ALR的表達能夠抑制U266細胞的增殖，并且通過影響凋亡相關(guān)因子Bax和Bc l-2來調(diào)控U266細胞的凋亡。
　　第三部分:表達ALR shRNA慢病毒感染U266細胞株后多個家族細胞因子變化情況

14、的研究。
　　目的:通過前兩部分我們證實了ALR對U266細胞株的促增殖和抗凋亡作用，本部分利用慢病毒轉(zhuǎn)染U266細胞株沉默ALR基因表達后，ELISA法檢測與多發(fā)性骨髓瘤增殖和凋亡相關(guān)的多個家族細胞因子變化，篩選出可能與ALR蛋白表達相關(guān)的細胞因子，從而為進一步的機制研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:利用ELISA法分別檢測表達ALR shRNA慢病毒感染U266細胞株后細胞因子IL-6、IL-10、VEGF、TNF-α的水平。<