miR-186抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制研究.pdf

1、多發(fā)性骨髓瘤(Multiple Myeloma，MM)是一種常見的血液系統(tǒng)惡性疾病，其發(fā)病率較高。這種疾病的特點(diǎn)為骨髓中惡性漿細(xì)胞克隆性增殖，血液及尿液中可查見單克隆蛋白以及出現(xiàn)相關(guān)器官功能障礙。臨床表現(xiàn)主要包括溶骨性損傷、貧血、高鈣血癥、腎功能損傷及反復(fù)感染等。盡管近年來對(duì)于多發(fā)性骨髓瘤的認(rèn)識(shí)及其診治取得了較快的發(fā)展，但其本質(zhì)上仍是一種不可治愈的疾病，因此，亟待一種更新、更有效的治療方案。
　　MicroRNAs是一組小的非編碼

2、RNA，在轉(zhuǎn)錄水平，它通過與靶基因3'UTR端的綁定來負(fù)向調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。miRNA已被報(bào)道在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。作為抑癌基因或者致癌基因，miRNA參與了腫瘤生物學(xué)的多個(gè)方面，包括細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移及侵犯。正因?yàn)樵谀[瘤中的重要作用，miRNA呈現(xiàn)為一個(gè)比較有吸引力的治療靶點(diǎn)，miRNA將會(huì)成功的應(yīng)用于臨床并使臨床獲益。
　　MicroRNA可以調(diào)節(jié)多種蛋白的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)多種生理及病理過程。在多種腫瘤中我們都

3、可以發(fā)現(xiàn)異常的miRNA表達(dá)，包括多發(fā)性骨髓瘤，這表明異常的miRNA表達(dá)與腫瘤的發(fā)生相關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-186可以作為一種抑癌基因，抑制多種腫瘤的發(fā)生，包括肺癌、食管及結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、膀胱癌等。然而miR-186在多發(fā)性骨髓瘤中的表達(dá)方式及功能仍然未知。在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們研究了多發(fā)性骨髓瘤中miR-186的表達(dá)方式及其特定的功能。
　　目的：
　　研究miR-186在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系及患者漿細(xì)胞

4、中的表達(dá)特性，探討miR-186對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，并進(jìn)一步研究其在多發(fā)性骨髓瘤中發(fā)揮作用的機(jī)制，為深入了解多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病機(jī)制，尋找更新、更有效治療方案奠定理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.患者標(biāo)本及細(xì)胞系:留取30例多發(fā)性骨髓瘤患者及18例健康對(duì)照者骨髓標(biāo)本，用CD138磁珠分選其漿細(xì)胞。選取并培養(yǎng)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系(MM.1S，OPM-2, NCI-H929, U266, RPMI-8226)。

5、　　2.慢病毒制備及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染:擴(kuò)增miR-186序列，并克隆到HU6-MCS-PGK-EGFP慢病毒載體，感染293T細(xì)胞，獲得穩(wěn)定表達(dá)miR-186的病毒顆粒，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞系U266和RPMI-8226細(xì)胞。用miR-186拮抗劑及拮抗劑陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞系H929細(xì)胞。細(xì)胞系miR-186的表達(dá)水平用qRT-PCR證實(shí)。
　　3.RNA的抽提及qRT-PCR:應(yīng)用TRIzol抽提細(xì)胞中的全部RNA，進(jìn)一步合成cD

6、NA，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR測定miR-186及Jagged1的表達(dá)水平。
　　4.質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染:克隆缺少內(nèi)源性Jagged13'UTR的開放讀碼框進(jìn)入pcDNA-Jagged1表達(dá)載體進(jìn)行miR-186抗細(xì)胞增殖效應(yīng)的營救實(shí)驗(yàn)。在熒光素酶實(shí)驗(yàn)中，Jagged1的3'UTR序列被插入到pGL3熒光素酶報(bào)告基因中，應(yīng)用QuikChange定向誘變?cè)噭┖袑形稽c(diǎn)進(jìn)行突變，并根據(jù)制造商的說明應(yīng)用Lipofectamine2000試劑進(jìn)行

7、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染。
　　5.細(xì)胞的增殖及平板細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn):在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用MTT法在細(xì)胞轉(zhuǎn)染24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)檢測細(xì)胞的增殖能力。在克隆形成實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周，然后加入甲醇固定，結(jié)晶紫染色，在顯微鏡底下進(jìn)行細(xì)胞克隆計(jì)數(shù)。
　　6.細(xì)胞周期分析:轉(zhuǎn)染48小時(shí)后用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，預(yù)冷的乙醇固定過夜，碘化丙啶染色。用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期。
　　7.裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn):將BALB/C裸鼠

8、右側(cè)腋窩皮下注射表達(dá)或不表達(dá)miR-186的RPMI-8226細(xì)胞，觀察腫瘤的生長，測量其大小，并計(jì)算其體積。細(xì)胞注射30天后，摘除腫瘤并應(yīng)用免疫組化法測定Ki-67，以獲取細(xì)胞增殖指數(shù)。
　　8.熒光素酶報(bào)告基因:應(yīng)用Lipofectamine2000，將野生型或突變型Jagged1-3'UTR表達(dá)載體與表達(dá)miR-186的質(zhì)?；蚩瞻踪|(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)入U(xiǎn)266或RPMI-8226細(xì)胞，利用雙熒光素酶報(bào)告基因方法測定熒光素酶的活性。<

9、br>　　9.Western blot實(shí)驗(yàn):應(yīng)用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，通過凝膠電泳分離全部蛋白，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜。在5％脫脂乳阻斷后，將膜加入一抗Jagged1抗體孵育，抗Actin抗體作為對(duì)照，在洗膜之前加入過氧化物酶結(jié)合的二抗。最終，經(jīng)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑處理，在X線膠片上成像。
　　10.統(tǒng)計(jì)分析:所有的數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，不同組之間比較使用t檢驗(yàn)（雙側(cè)），應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05視

10、為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為保證實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性，所有的實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3遍。
　　結(jié)果：
　　1.miR-186在多發(fā)性骨髓瘤中表達(dá)下調(diào):通過實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系MM.1S，OPM-2，NCI-H929，U266，RPMI-8226及患者骨髓漿細(xì)胞miR-186的表達(dá)，并與健康對(duì)照組骨髓來源漿細(xì)胞相對(duì)比。結(jié)果顯示，在所有檢測的骨髓瘤細(xì)胞系中，miR-186的表達(dá)均下降，其中U266、RPMI-8226表達(dá)最低;與這些結(jié)果

11、相一致，骨髓瘤患者漿細(xì)胞表達(dá)miR-186亦下調(diào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持，在多發(fā)性骨髓瘤中，miR-186為一種潛在腫瘤抑制基因。
　　2.miR-186抑制骨髓瘤細(xì)胞增殖，并使細(xì)胞周期停滯在G0/G1期:為探究miR-186對(duì)骨髓瘤細(xì)胞增殖的影響，我們利用miR-186重組慢病毒轉(zhuǎn)染U266、RPMI-8226細(xì)胞系，然后通過qRT-PCR證實(shí)miR-186在這些細(xì)胞中過表達(dá)。MTT實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，與對(duì)照組相比，過表達(dá)miR-186的U26

12、6、RPMI-8226細(xì)胞的增殖顯著下降;平板細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-186顯著抑制U266、RPMI-8226細(xì)胞克隆的形成。我們進(jìn)一步應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測miR-186對(duì)細(xì)胞周期的影響，與對(duì)照組相比，miR-186過表達(dá)導(dǎo)致G0/G1期的細(xì)胞比例顯著增加，S期細(xì)胞比例減少，使細(xì)胞周期停滯在G0/G1期。與之相反，在H929細(xì)胞系中，應(yīng)用miR-186的拮抗劑來抑制miR-186的表達(dá)可以顯著提升細(xì)胞的增殖及增加S期細(xì)

13、胞的比例。這些結(jié)果共同提示miR-186抑制骨髓瘤細(xì)胞的增殖歸因于G0/G1期細(xì)胞周期的阻滯。
　　3.miR-186抑制裸鼠骨髓瘤移植物的生長:為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-186是否對(duì)體內(nèi)腫瘤的生長有抑制作用，我們分別將穩(wěn)定表達(dá)miR-186或陰性對(duì)照的RPMI-8226細(xì)胞皮下注射到裸鼠右側(cè)腋下。與陰性對(duì)照組相比，穩(wěn)定表達(dá)miR-186的RPMI-8226細(xì)胞種植小鼠腫瘤生長速度緩慢;種植后30天，穩(wěn)定表達(dá)miR-186組腫瘤重量最小

14、;另外，免疫組化顯示Ki-67陽性細(xì)胞在miR-186表達(dá)組中顯著降低。
　　4.miR-186調(diào)控Jagged1的表達(dá):為進(jìn)一步探究miR-186介導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，我們通過TargetScan尋找miR-186可能的靶基因，在這些被鑒別的靶基因中，考慮到對(duì)骨髓瘤細(xì)胞增殖及生存的影響，Jagged1被選擇為miR-186的候選靶基因。為確定Jagged1是否為miR-186的直接下游靶點(diǎn)，我們克隆Jagged1的3'U

15、TR序列進(jìn)入pGL3熒光素酶報(bào)告基因載體，U266、RPMI-8226細(xì)胞與野生型或突變型3'UTR載體及表達(dá)miR-186的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。與對(duì)照組相比，過表達(dá)miR-186使轉(zhuǎn)染野生型Jagged1-3'UTR的熒光素酶活性顯著下降，而對(duì)突變型3'UTR的熒光素酶活性無影響;qRT-PCR結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-186對(duì)Jagged1 mRNA水平無影響，而western blot結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-186的U266

16、、RPMI-8226細(xì)胞Jagged1蛋白水平顯著下降。轉(zhuǎn)染miR-186拮抗劑的H929細(xì)胞Jagged1蛋白水平顯著上升?；谶@些研究結(jié)果，我們推斷miR-186通過靶向Jagged1-3'UTR來調(diào)節(jié)其蛋白的表達(dá)。
　　5.Jagged1過表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)miR-186的作用:為進(jìn)一步說明Jagged1是否為miR-186的功能靶點(diǎn)，我們將敲除3'UTR的Jagged1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入miR-186表達(dá)的RPMI-8226細(xì)胞，進(jìn)行

17、功能獲得性分析。免疫印記法結(jié)果顯示，與RPMI-8226或RPMI-8226/miR-186相比，轉(zhuǎn)染敲除Jagged1-3'UTR質(zhì)粒的細(xì)胞表達(dá)Jagged1水平顯著增高。過表達(dá)Jagged1可以顯著逆轉(zhuǎn)miR-186所致的細(xì)胞生長抑制、平板集落形成的減少以及對(duì)細(xì)胞周期的阻滯。這些數(shù)據(jù)表明miR-186通過抑制Jagged1的表達(dá)來抑制細(xì)胞的增殖。
　　結(jié)論：
　　1.多發(fā)性骨髓瘤患者漿細(xì)胞及骨髓瘤細(xì)胞系miR-186的表