ClC-3氯通道過(guò)表達(dá)對(duì)小鼠骨骼的影響.pdf

1、目的：骨的生長(zhǎng)代謝由多種因素參與調(diào)控，研究表明骨的生長(zhǎng)代謝與Ca2+、K+等多種離子通道相關(guān)。氯離子通道廣泛分布于多種組織，電壓門控氯通道家族蛋白成員3（voltage-gated chloride channel family protein3。ClC-3）作為ClC型氯離子家族通道中一種重要的亞型，在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞上均有表達(dá)并且參與了成骨細(xì)胞的骨形成與破骨細(xì)胞的骨吸收，提示其與骨代謝有著密切的關(guān)系。但目前尚不了解ClC-3氯通道

2、對(duì)骨代謝的具體作用及作用機(jī)制。本研究以ClC-3過(guò)表達(dá)小鼠為主要研究對(duì)象，觀察脛骨松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨的骨量與骨結(jié)構(gòu)的變化及股骨生物力學(xué)的改變，并探討這些改變的可能因素，以了解小鼠ClC-3氯通道對(duì)骨代謝的影響。
　　方法：導(dǎo)入含有CLCN3基因和綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因的質(zhì)粒構(gòu)建ClC-3氯通道過(guò)表達(dá)的FVB小鼠，鼠尾基因檢測(cè)確定并選擇ClC-3過(guò)表達(dá)型（ClC-3 transge

3、ne）小鼠為主要研究對(duì)象。實(shí)驗(yàn)主要分為野生型（WT）組和ClC-3過(guò)表達(dá)型組。每組小鼠從出生開(kāi)始，每隔一個(gè)月測(cè)量體重及體長(zhǎng)，每組在飼養(yǎng)至一月齡，三月齡，九月齡時(shí)分別取雄性和雌性小鼠各10只處死并分離出右側(cè)脛骨和股骨作為實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象。測(cè)量脛骨的重量和長(zhǎng)度。對(duì)脛骨上段（proximal tibial metaphysis，PTM）和脛骨中段（middle part of tibia shaft。TX）進(jìn)行脫鈣，石蠟包埋，切片。切片脫蠟后熒光

4、拍照進(jìn)一步確認(rèn)小鼠的基因型。切片HE染色后骨形態(tài)計(jì)量學(xué)分析脛骨上段松質(zhì)骨的骨量參數(shù)即骨小梁面積百分?jǐn)?shù)（percent trabecular area,％Tb.Ar）和骨結(jié)構(gòu)參數(shù)即骨小梁數(shù)量（trabecular number。Tb.N）、骨小梁寬度（trabecular width。Tb.Wi）和骨小梁分離度（trabecular separation。Tb.Sp）；分析脛骨中段皮質(zhì)骨的骨組織總面積（total tissue area。

5、T.Ar）、皮質(zhì)骨面積（cortical area。Ct.Ar）、皮質(zhì)骨面積百分?jǐn)?shù)（percent cortical area,%Ct.Ar）、骨髓腔面積（marrow area。Ma.Ar）、骨髓腔面積百分?jǐn)?shù)（percent marrow area,%Ma.Ar）的變化。對(duì)股骨行三點(diǎn)彎曲骨生物力學(xué)測(cè)試并分析最大載荷和最大應(yīng)力的變化。進(jìn)一步檢測(cè)比較WT組和ClC-3 transgene組堿性磷酸酶（alkaline phosphatas

6、e。ALP）表達(dá)的高低。
　　結(jié)果：
　　1.轉(zhuǎn)基因小鼠基因檢測(cè)
　　小鼠經(jīng)鼠尾DNA檢測(cè)后確認(rèn)為野生型或ClC-3過(guò)表達(dá)型，石蠟切片的熒光拍照?qǐng)D片進(jìn)一步確認(rèn)小鼠基因型。成功構(gòu)建ClC-3過(guò)表達(dá)小鼠。
　　2. ClC-3過(guò)表達(dá)對(duì)小鼠體重和體長(zhǎng)的影響
　?。?）雌性小鼠體重和體長(zhǎng)變化
　　隨著時(shí)間的增長(zhǎng)WT組在一月齡至七月齡時(shí)體重逐漸增加，八月齡至九月齡時(shí)體重大幅增加，ClC-3 transgene組

7、小鼠體重呈現(xiàn)相同趨勢(shì)。與WT組相比，ClC-3 transgene組小鼠在各月齡中體重均有減輕，且在二月齡和三月齡時(shí)其減少有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　隨著時(shí)間的增長(zhǎng)WT組在一月齡至九月齡時(shí)體長(zhǎng)逐漸增加，ClC-3 transgene組小鼠體長(zhǎng)呈現(xiàn)相同趨勢(shì)。與WT組相比，ClC-3 transgene組小鼠在各月齡中體長(zhǎng)均有減小，且在二月齡和三月齡時(shí)其減少有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　（2）雄性小鼠體重和體長(zhǎng)變化

8、
　　隨著時(shí)間的增長(zhǎng)WT組在一月齡至七月齡是體重逐漸增加，八月齡至九月齡時(shí)體重略有減輕，ClC-3 transgene組小鼠體重呈現(xiàn)相同趨勢(shì)。與WT組相比，ClC-3 transgene組小鼠在各月齡中體重均有減輕，且在二月齡和三月齡時(shí)其減少有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　隨著時(shí)間的增長(zhǎng)WT組在一月齡至九月齡時(shí)體長(zhǎng)逐漸增加，ClC-3 transgene組小鼠體長(zhǎng)呈現(xiàn)相同趨勢(shì)。與WT組相比，ClC-3 transgene

9、組小鼠在各月齡中體長(zhǎng)均有減小，且在二月齡至四月齡時(shí)其減少有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　3. ClC-3過(guò)表達(dá)對(duì)小鼠脛骨重量和長(zhǎng)度的影響
　　（1）雌性小鼠脛骨重量和長(zhǎng)度變化
　　隨著時(shí)間的增長(zhǎng)WT組脛骨重量在一月齡至七月齡時(shí)逐漸增加，八月齡至九月齡時(shí)略有減輕。ClC-3 transgene組脛骨重量在一月齡至八月齡時(shí)逐漸增加，九月齡時(shí)略有減輕。與WT組相比，ClC-3 transgene組小鼠在各月齡中脛骨重量均

10、有減小，且在一月齡至四月齡時(shí)其減少有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　隨著時(shí)間的增長(zhǎng)WT組脛骨長(zhǎng)度在一月齡至九月齡時(shí)逐漸增加。ClC-3 transgene組小鼠脛骨長(zhǎng)度呈現(xiàn)相同趨勢(shì)。與WT組相比，ClC-3 transgene組小鼠在各月齡中脛骨長(zhǎng)度均有減小，且在一月齡和二月齡時(shí)其減少有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　（2）雄性小鼠脛骨重量和長(zhǎng)度變化
　　隨著時(shí)間的增長(zhǎng)WT組脛骨重量在一月齡至四月齡時(shí)逐漸增加，五月

11、齡至九月齡時(shí)基本平穩(wěn)。ClC-3 transgene組脛骨重量在一月齡至九月齡時(shí)逐漸增加。與WT組相比，ClC-3 transgene組小鼠在各月齡中脛骨重量均有減小，且在一月齡至四月齡時(shí)其減少有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　隨著時(shí)間的增長(zhǎng)WT組脛骨長(zhǎng)度在一月齡至九月齡時(shí)逐漸增加。ClC-3 transgene組小鼠脛骨長(zhǎng)度呈現(xiàn)相同趨勢(shì)。與WT組相比，ClC-3 transgene組小鼠在各月齡中脛骨長(zhǎng)度均有減小，且在二月齡和

12、四月齡時(shí)其減少有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　4. ClC-3過(guò)表達(dá)對(duì)小鼠脛骨上段松質(zhì)骨影響
　　（1）雌性小鼠脛骨上段松質(zhì)骨變化
　　WT組骨量參數(shù)即%Tb.Ar在一月齡至三月齡中逐漸增大，在九月齡時(shí)減小。骨結(jié)構(gòu)參數(shù)Tb.Wi及Tb.N在一月齡至三月齡中逐漸增大，在九月齡時(shí)減??；Tb.Sp在一月齡至三月齡中逐漸減小，在九月齡時(shí)增大。ClC-3 transgene組骨量和骨結(jié)構(gòu)參數(shù)呈現(xiàn)相同趨勢(shì)。與WT組相比，ClC

13、-3 transgene組小鼠各月齡的%Tb.Ar、Tb.Wi和Tb.N均有減小，Tb.Sp均有增大，且ClC-3 transgene組%Tb.Ar在一月齡和三月齡的減少有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），Tb.Wi在三月齡的減少有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Tb.Sp在三月齡的增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　?。?）雄性小鼠脛骨上段松質(zhì)骨變化
　　WT組骨量參數(shù)即%Tb.Ar在一月齡至三月齡中逐漸增大，在九月

14、齡時(shí)大幅減小。骨結(jié)構(gòu)參數(shù)Tb.Wi及Tb.N在一月齡至三月齡中逐漸增大，在九月齡時(shí)減小；Tb.Sp在一月齡至三月齡中逐漸減小，在九月齡時(shí)增大。ClC-3 transgene組骨量和骨結(jié)構(gòu)參數(shù)呈現(xiàn)相同趨勢(shì)。與WT組相比，ClC-3 transgene組小鼠各月齡的%Tb.Ar、Tb.Wi和Tb.N均有減小，且ClC-3 transgene組%Tb.Ar在一月齡的減少有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），在三月齡的減少也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）

15、。Tb.Wi在一月齡和三月齡的減少有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Tb.Sp在三月齡的增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　5. ClC-3過(guò)表達(dá)對(duì)小鼠脛骨中段皮質(zhì)骨影響
　?。?）雌性小鼠脛骨中段皮質(zhì)骨變化
　　WT組骨量絕對(duì)參數(shù)即T.Ar和Ct.Ar在一月齡至九月齡時(shí)隨時(shí)間變化逐漸增大；相對(duì)參數(shù)%Ct.Ar在一月齡至三月齡時(shí)逐漸增大，在九月齡時(shí)減少；Ma.Ar和%Ma.Ar在一月齡至三月齡時(shí)逐漸減少，在九月齡時(shí)增加

16、。ClC-3 transgene組骨量參數(shù)呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)。與WT組相比，ClC-3 transgene組小鼠各月齡的T.Ar、Ct.Ar和%Ct.Ar均有減少，Ma.Ar和%Ma.Ar均有增加，且T.Ar在三月齡時(shí)的變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Ct.Ar、%Ct.Ar和%Ma.Ar在三月齡和九月齡時(shí)的變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Ma.Ar在九月齡時(shí)的變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　（2）雄性小鼠脛骨中段皮質(zhì)骨變

17、化
　　WT組骨量絕對(duì)參數(shù)即T.Ar、Ct.Ar和相對(duì)參數(shù)%Ct.Ar在一月齡至三月齡時(shí)隨時(shí)間變化逐漸增大，在三月齡至九月齡時(shí)基本保持穩(wěn)定；Ma.Ar和%Ma.Ar在一月齡至三月齡逐漸減小，在三月齡至九月齡時(shí)基本保持穩(wěn)定。ClC-3 transgene組骨量參數(shù)呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)。與WT組相比，ClC-3 transgene組小鼠各月齡的T.Ar、Ct.Ar和%Ct.Ar均有減少，Ma.Ar和%Ma.Ar均有增加，且T.Ar在三月齡時(shí)

18、的變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Ct.Ar、%Ct.Ar、Ma.Ar和%Ma.Ar在三月齡和九月齡時(shí)的變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　6. ClC-3過(guò)表達(dá)對(duì)小鼠股骨生物力學(xué)的影響
　?。?）雌性小鼠股骨生物力學(xué)變化
　　WT組最大載荷在一月齡至三月齡中逐漸增大，在九月齡時(shí)減小。ClC-3 transgene組呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)。與WT組相比，ClC-3 transgene組的最大載荷在各月齡均有減少，且在三月

19、齡時(shí)其減小有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　WT組最大應(yīng)力在一月齡至三月齡中逐漸增大，在九月齡時(shí)減小。ClC-3 transgene組呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)。與WT組相比，ClC-3 transgene組的最大應(yīng)力在各月齡均有減少，且在三月齡時(shí)其減小有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　?。?）雄性小鼠股骨生物力學(xué)變化
　　WT組最大載荷在一月齡至三月齡中增大，在九月齡時(shí)減小。ClC-3 transgene組呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)。與W

20、T組相比，ClC-3 transgene組的最大載荷在各月齡均有減少，且在三月齡時(shí)其減小有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　WT組最大應(yīng)力在一月齡至三月齡中增大，在九月齡時(shí)減小。ClC-3 transgene組呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)。與WT組相比，ClC-3 transgene組的最大應(yīng)力在各月齡均有減少，且在一月齡和三月齡時(shí)其減小有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　7. ClC-3過(guò)表達(dá)對(duì)小鼠堿性磷酸酶水平的影響
　　與WT

21、組相比，ClC-3 transgene組堿性磷酸酶水平的表達(dá)減少（P<0.05）。
　　結(jié)論：ClC-3氯通道過(guò)表達(dá)明顯的影響骨骼的生長(zhǎng)發(fā)育，表現(xiàn)為小鼠體重、體長(zhǎng)、脛骨的長(zhǎng)度和重量的改變；特別是松質(zhì)骨骨小梁骨量的減少和骨結(jié)構(gòu)的破壞；皮質(zhì)骨骨外膜面骨量減少和骨內(nèi)膜骨髓腔增大，使皮質(zhì)骨絕對(duì)值和相對(duì)值骨量都減少，這些結(jié)果影響骨骼的材料力學(xué)和結(jié)構(gòu)力學(xué)的性能，導(dǎo)致骨質(zhì)量的降低。骨生物力學(xué)結(jié)果顯示ClC-3氯通道過(guò)表達(dá)可能對(duì)雌性小鼠骨質(zhì)量影響