過(guò)表達(dá)Nanog基因的小鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞對(duì)帕金森病小鼠NF-κB表達(dá)的影響.pdf

1、帕金森病成為困擾許多中老年人的常見病，目前還沒有一個(gè)有效的方法能阻止本病的進(jìn)展。近年來(lái)，隨著對(duì)該病研究的進(jìn)一步深入，最終治療將寄希望于新技術(shù)的成熟，如基因治療和干細(xì)胞治療。尤其，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)帕金森病與NF-κB的過(guò)度表達(dá)有關(guān)。2008年Torres等在Nat Cell Biol.發(fā)表論著，發(fā)現(xiàn)Nanog基因可抑制NF-κB的表達(dá)。為充分應(yīng)用這一發(fā)現(xiàn)，本課題組已經(jīng)通過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切和基因重組的方法，成功構(gòu)建攜帶Nanog基因的重組慢病毒

2、表達(dá)載體質(zhì)粒PNL-Nanog-IRES2-EGFP。本研究繼續(xù)構(gòu)建攜帶小鼠Nanog基因的慢病毒載體并感染小鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，觀察過(guò)表達(dá)的Nanog對(duì)NF-κB表達(dá)的影響，為神經(jīng)變性疾病的治療提供新思路。本課題分三部分。
　　 第一部分：過(guò)表達(dá)Nanog基因的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的構(gòu)建、培養(yǎng)與鑒定
　　 1、方法：
　　 (1)將三質(zhì)粒PNL-Nanog-IRES2-EGFP或PNL-IRES2-EGFP、pHELP

3、ER和pVSVG共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝生產(chǎn)慢病毒；
　　 (2)經(jīng)超速離心收集病毒顆粒，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定EGFP蛋白表達(dá)率來(lái)測(cè)定慢病毒功能滴度；
　　 (3)分別用攜帶相應(yīng)目的基因的相同滴度慢病毒感染mMSCs；
　　 (4)用RT-PCR、Western Blot和ELISA分別檢測(cè)mMSCs的Nanog的mRNA、蛋白質(zhì)，以及該細(xì)胞上清液中Nanog表達(dá)水平。
　　 2、結(jié)果：

4、r>　　 (1)三質(zhì)粒PNL-Nanog-IRES2-EGFP或PNL-IRES2-EGFP、pHELPER和pVSVG共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝產(chǎn)生慢病毒。
　　 (2)未濃縮含病毒的細(xì)胞培養(yǎng)上清和濃縮的病毒懸液的功能滴度分別是6.5×104TU/mL和6.8×106 TU/mL。
　　 (3)RT-PCR、Western Blot和ELISA均證實(shí)Nanog-mMSCs組的Nanog蛋白表達(dá)增多，與空載體組相比較差異

5、性有顯著意義。
　　 3、結(jié)論：成功構(gòu)建過(guò)表達(dá)Nanog基因的mMSCs。
　　 第二部分：mMSCs過(guò)表達(dá)Nanog基因?qū)F-κB表達(dá)的影響
　　 1、方法：
　　 (1)慢病毒的包裝、濃縮和感染mMSCs的方法同上，將慢病毒液加入mMSCs中，感染mMSCs，熒光顯微鏡觀察表達(dá)情況。
　　 (2)實(shí)驗(yàn)分組：Nanog-mMSCs組為攜帶Nanog基因慢病毒感染的mMSCs組；Mock-mMS

6、Cs組(或PNL-mMSCs組)為未攜帶目的墓因的慢病毒感染的mMSCs組，mMSCs組為未經(jīng)慢病毒感染的mMSCs組。
　　 (3)檢測(cè)感染后的各組mMSCs中Nanog及NF-κB的表達(dá)情況。
　　 2、結(jié)果：
　　 (1)慢病毒感染mMSCs后，熒光顯微鏡下觀察，PNL-MSCs組和Nanog-mMSCs組均可檢測(cè)到綠色熒光表達(dá)，未感染的mMSCs未見熒光表達(dá)。
　　 (2)細(xì)胞免疫熒光、RT-PC

7、R和Western Blot檢測(cè)Mock-mMSCs組及mMSCs組NF-κBp65表達(dá)量高于Nanog-mMSCs組。
　　 3、結(jié)論：在mMSCs培養(yǎng)的體外實(shí)驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)Nanog能抑制NF-κB表達(dá)。
　　 第三部分：過(guò)表達(dá)Nanog基因的mMSCs對(duì)帕金森病小鼠NF-κB表達(dá)的影響
　　 1、方法：
　　 (1)選10～12周齡，體重25～30克成年C57BL雄性褐鼠制作小鼠帕金森模型。
　

8、　 (2)與造模型的同日開始進(jìn)行單次Nanog-mMSCs、Mock-mMSCs立體定向注射到模型鼠紋狀體，對(duì)照組只注射PBS。
　　 (3)取小鼠腦制作冰凍切片在熒光顯微鏡下觀察各組的NF-κB在黑質(zhì)、紋狀體的表達(dá)情況，以及觀察黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)量。
　　 2、結(jié)果：
　　 (1)成功建立帕金森病小鼠模型。
　　 (2)小鼠腦冰凍切片觀察結(jié)果顯示Mock-mMSCs組及mMSCs組NF-κBp65