鈣激活氯通道TMEM16A在小鼠心肌組織的表達.pdf

1、目的:鈣激活氯通道(Calcium-activatedCholirdeChannels,CaCC)是心肌主要的氯離子通道之一,該通道與正常心肌細胞的電活動和某些心臟疾病(如心肌梗死,心力衰竭)關系密切。本實驗探討鈣激活氯通道蛋白TMEM16A在小鼠心肌組織的表達。
　　 材料和方法:1.清潔級昆明種小鼠購自青島市藥檢所。成年小鼠,體重25-35mg,新生小鼠出生1-3天內使用。2.拉頸處死后迅速取出心臟,取50-100mg心肌組

2、織以Trizol試劑提取總RNA。以提取的DNA為模板,采用RT-PCR檢測心肌TMEM16AmRNA的表達。3.成年小鼠快速處死后取出lOOmg心肌組織,4g/L多聚甲醛(4℃)固定6-8h,轉入300g/L蔗糖放置24h至沉底,做14um厚連續(xù)冷凍切片。免疫熒光法檢測心肌TMEM16A蛋白的表達。4.成年小鼠取出心臟后,用RIPA裂解液裂解后提取蛋白,酶標儀測出蛋白濃度,免疫印跡法檢測成年小鼠心肌組織的TMEM16A蛋白的表達。

3、r>　　 結果:1.新生及成年小鼠TMEM16A目的基因的擴增條帶為330bp,與TMEM16AcDNA陽性對照位于同一水平,提示二者心肌均有TMEM16AmRNA的表達。差異無顯著性(n=4,t:0.7698,P＞0.05)。2.成年小鼠心肌切片用兔抗鼠TMEM16A抗體(一抗)處理后再加FITC標記的山羊抗兔IgG(二抗)染色,激光共聚焦顯微鏡下顯示綠色熒光信號,WGA-TMR標記的細胞膜呈紅色熒光,二者融合呈黃色。陰性對照(PB

4、S代替一抗)未見綠色熒光,僅見紅色的細胞膜。提示小鼠心肌組織存在TMEM16A蛋白的表達,且主要定位于細胞膜上。3.成年小鼠TMEM16A目的基因的擴增條帶是130kb,與TMEM16A陽性對照位于同一水平,提示成年小鼠心肌組織中有TMEM16A的表達。
　　 結論:本研究利用分子生物學、免疫熒光染色技術和免疫印跡法,在小鼠心肌組織成功地檢測到TMEM16AmRNA和蛋白的表達。新生小鼠和成年小鼠TMEM16AmRNA水平無明顯