TMEM16A對(duì)高肺血流性肺動(dòng)脈高壓調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 TMEM16A在高肺血流性肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上的表達(dá)及特征
　　目的:驗(yàn)證TMEM16A在大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上的表達(dá)及分布規(guī)律，探索可能由TMEM16A介導(dǎo)的CaCC的電生理學(xué)特點(diǎn)。
　　方法:將SD大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組和分流組。通過(guò)腹主動(dòng)脈-下腔靜脈造瘺分流法建立高肺血流性肺動(dòng)脈高壓大鼠模型，術(shù)后11周測(cè)定肺動(dòng)脈壓力。HE染色及免疫組化檢測(cè)TMEM

2、16的分布;qRT-PCR檢測(cè)TMEM16A mRNA在各組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的表達(dá)水平;Westem blot檢測(cè)TMEM16A蛋白的表達(dá);全細(xì)胞膜片鉗記錄CaCC電生理學(xué)特點(diǎn)。
　　結(jié)果:分流組大鼠肺動(dòng)脈壓力較正常組和假手術(shù)組顯著上升(P＜0.01)，提示分流手術(shù)成功建立高肺血流性肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型。HE染色病理檢查可見(jiàn)分流組大鼠肺小動(dòng)脈管壁增厚、管腔狹窄。免疫組織化學(xué)染色顯示TMEM16A主要分布于肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜。qRT-

3、PCR結(jié)果顯示，分流組TMEM16A mRNA表達(dá)水平較正常組和假手術(shù)組顯著增高(P＜0.01)，而正常組和假手術(shù)組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。Westernblot結(jié)果顯示，分流組TMEM16A蛋白表達(dá)水平較正常組和假手術(shù)組均顯著增高(P＜0.01)，而正常組和假手術(shù)組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。通過(guò)全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)在肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞記錄到穩(wěn)定的CaCC電生理特征，其表現(xiàn)出外向整流性和Ca2+敏感性。分流組肺動(dòng)脈平滑肌

4、細(xì)胞的電流密度較正常組和假手術(shù)組顯著增高，I-V曲線(xiàn)上移（P＜0.01），而正常組和假手術(shù)組之間電流密度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:(1)TMEM16A在高肺血流性肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上存在高表達(dá)，可能參與了肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生過(guò)程。(2)高肺血流性肺動(dòng)脈高壓發(fā)生過(guò)程中，肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜上電流及電流密度增高，可能是肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生機(jī)制之一。
　　第二部分 TMEM16A對(duì)高肺血流性肺動(dòng)脈高壓中鈣激活性氯

5、離子通道的調(diào)控作用
　　目的:為了進(jìn)一步探索高肺血流性肺動(dòng)脈高壓中TMEM16A是否調(diào)控肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上的CaCC及其電生理變化，我們通過(guò)構(gòu)建慢病毒載體、RNAi技術(shù)下調(diào)TMEM16A基因的表達(dá)，從而為進(jìn)一步闡明TMEM16A在高肺血流性肺動(dòng)脈高壓中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　方法:根據(jù)第一部分建立的高肺血流性肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型，動(dòng)物分組、肺動(dòng)脈壓力測(cè)定、原代肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)均同第一部分。利用RNAi技術(shù)，制備慢病毒載體后進(jìn)

6、行慢病毒包裝，對(duì)特異性目的基因TMEM16A進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。通過(guò)qRT-PCR和Western blot分別檢測(cè)慢病毒對(duì)TMEM16A基因mRNA和蛋白的干擾效率。篩選出最高效率的干擾載體，通過(guò)qRT-PCR和Western blot分別檢測(cè)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后TMEM16A基因mRNA和蛋白表達(dá)量的變化。全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后電生理變化。
　　結(jié)果:經(jīng)過(guò)慢病毒載體的制備、慢病毒包裝和細(xì)胞轉(zhuǎn)染等步驟，順利將帶有綠色熒光

7、的慢病毒轉(zhuǎn)染至肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中。qRT-PCR和Western blot方法篩選出具有最高效率的干擾載體(83％)。對(duì)轉(zhuǎn)染前后各組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的TMEM16A mRNA表達(dá)量進(jìn)行比較，正常組、假手術(shù)組和分流組的表達(dá)量較各自轉(zhuǎn)染之前顯著下降（P＜0.01）。轉(zhuǎn)染前后各組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的TMEM16A蛋白表達(dá)量進(jìn)行比較，正常組、假手術(shù)組和分流組的表達(dá)量均較各自轉(zhuǎn)染之前顯著下降（P＜0.05）。正常組、假手術(shù)組和分流組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞

8、在轉(zhuǎn)染前后電流顯著下降，電流密度均較各自轉(zhuǎn)染之前顯著下降（P＜0.01）。轉(zhuǎn)染后分流組CaCC電流密度較轉(zhuǎn)染后正常組（P＜0.01）和假手術(shù)組(P＜0.05)均顯著增加，而轉(zhuǎn)染后正常組與轉(zhuǎn)染后假手術(shù)組CaCC電流密度之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:(1)成功構(gòu)建表達(dá)TMEM16A基因siRNA的慢病毒載體并篩選出具有較高干擾效率的RNA干擾載體。(2)經(jīng)RT-PCR和Western blot證實(shí)，通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染方式有效

9、降低TMEM16A mRNA和蛋白表達(dá)，降低細(xì)胞膜電流及電流密度。(3)TMEM16A通過(guò)調(diào)控CaCC的方式參與高肺血流性肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生。
　　第三部分 TMEM16A對(duì)高肺血流性肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響及作用途徑
　　目的:第二部分通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方式下調(diào)TMEM16A基因的表達(dá)，為進(jìn)一步研究該基因在高肺血流性肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生過(guò)程中的作用提供了重要的反向功能研究手段。因此我們繼續(xù)利用這一技術(shù)方法，探索TME

10、M16A對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖功能的影響及其可能作用的信號(hào)通路。
　　方法:根據(jù)第一部分建立的高肺血流性肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型，動(dòng)物分組、肺動(dòng)脈壓力測(cè)定、原代肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)均同前述部分，以肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，利用第二部分建立的RNA干擾載體進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖變化，應(yīng)用Westernblot檢測(cè)PCNA、P-ERK、ERK蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:細(xì)胞接種后48小時(shí)后，肺動(dòng)脈平滑肌

11、細(xì)胞逐步進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，分流組增殖活性較正常組和假手術(shù)組明顯增高(P＜0.01)，而正常組與假手術(shù)組之間無(wú)差異(P＞0.05)。各組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞進(jìn)行針對(duì)TMEM16A基因的轉(zhuǎn)染，敲低TMEM16A基因的各組細(xì)胞增殖速度均顯著下降(P＜0.01)。轉(zhuǎn)染前分流組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞PCNA表達(dá)量較正常組和假手術(shù)組顯著增高(P＜0.01)，而正常組與假手術(shù)組之間無(wú)差異（P＞0.05）。比較轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞PCNA表達(dá)量的變化，敲低TMEM16A基

12、因的各組細(xì)胞PCNA表達(dá)量均顯著下降(P＜0.01)。轉(zhuǎn)染前分流組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的P-ERK/ERK較正常組和假手術(shù)組顯著增高(P＜0.05)，而正常組與假手術(shù)組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。比較轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞P-ERK/ERK變化，敲低TMEM16A基因的各組細(xì)胞P-ERK/ERK均顯著下降(P＜0.05)。
　　結(jié)論:(1)TMEM16A促進(jìn)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖，從而參與高肺血流性肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生。(2)TMEM