T16Ainh-A01對(duì)高肺血流性肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖和遷移作用的研究.pdf

1、目的：采用腹主動(dòng)脈-下腔靜脈造瘺分流法構(gòu)建高肺血流肺動(dòng)脈高壓大鼠模型，探究跨膜蛋白16A（TMEM16A）特異性抑制劑（T16Ainh-A01）對(duì)原代肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖和細(xì)胞遷移的作用。
　　方法：30只SD大鼠采取數(shù)字表法隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組和模型組各10只。模型組通過(guò)腹主動(dòng)脈-下腔靜脈造瘺分流法建立左向右分流的高肺血流肺動(dòng)脈高壓模型；假手術(shù)組行簡(jiǎn)單的開(kāi)關(guān)腹手術(shù)；正常組不做任何處理。所有大鼠飼養(yǎng)11周后測(cè)定肺動(dòng)脈壓力。肺組

2、織HE染色，光鏡下觀察肺動(dòng)脈管壁情況；組織貼壁法分離大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs），細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞免疫化學(xué)及免疫熒光法對(duì)PASMCs進(jìn)行鑒定；免疫熒光法檢測(cè)TMEM16A在各組PASMCs上的表達(dá)；各組原代培養(yǎng)的PASMCs分別在10μM、20μM和50μM T16Ainh-A01干預(yù)下培養(yǎng)24 h，用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況；transwell小室法檢測(cè)各組 PASMCs分別在20μM和50μM T16Ainh-A01干預(yù)

3、24 h后細(xì)胞遷移數(shù)的情況。
　　結(jié)果：⑴大鼠肺動(dòng)脈壓力:模型組肺動(dòng)脈收縮壓、舒張壓及平均壓分別較正常組、假手術(shù)組的均顯劇升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。而正常組與假手術(shù)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。提示通過(guò)分流手術(shù)成功建立高肺血流性肺動(dòng)脈高壓大鼠模型。⑵HE肺組織染色病理檢查可見(jiàn)模型組肺小動(dòng)脈管壁明顯增厚、管腔明顯狹窄，而正常組及假手術(shù)組無(wú)此病理改變。⑶倒置顯微鏡下PASMCs以長(zhǎng)梭形為主，胞核卵圓形，部分細(xì)

4、胞重疊區(qū)域呈典型“峰-谷”狀結(jié)構(gòu)。免疫學(xué)檢測(cè)顯示胞漿內(nèi)可見(jiàn)PASMCs特有的被染成棕黃色和標(biāo)記紅色熒光的肌絲，而胞核不染色。⑷免疫熒光檢測(cè)各組PASMCs胞膜上均可見(jiàn)標(biāo)記TMEM16A的綠色熒光，模型組綠色熒光范圍較正常組及假手術(shù)組廣。⑸細(xì)胞增殖：10μM T16Ainh-A01干預(yù)各組PASMCs24 h后細(xì)胞活力（％）比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；20μM T16Ainh-A01干預(yù)各組PASMCs24 h后細(xì)胞活力（%）差

5、異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）:模型組細(xì)胞活力（%）（88.82±1.92），較正常組（92.21±1.25）明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而較假手術(shù)組（90.42±3.12）無(wú)明顯下降，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），正常組與假手術(shù)組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;50μM T16Ainh-A01干預(yù)各組PASMCs24 h后細(xì)胞活力（%）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）:模型組細(xì)胞活力（%）（74.48±5.

6、95），較正常組（87.41±3.27）、假手術(shù)組（83.73±4.05）均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而正常組與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。⑹細(xì)胞遷移：20μM T16Ainh-A01干預(yù)各組PASMCs24 h后遷移細(xì)胞數(shù)比較，正常干預(yù)組細(xì)胞遷移數(shù)（n）(76.25±2.87)、假手術(shù)干預(yù)組細(xì)胞遷移數(shù)(n)(81.75±2.06)，分別較正常不干預(yù)組(83.75±1.26)、假手術(shù)不干預(yù)組(88.7

7、5±2.21)均減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）,而模型干預(yù)組細(xì)胞遷移數(shù)(n)(92.25±4.27)較模型不干預(yù)組(123.75±3.77)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。同時(shí)模型組抑制率（%）（25.32±5.72），較正常組（8.98±2.21）、假手術(shù)組（7.85±2.88）均顯劇升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而正常組和假手術(shù)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；50μM T16Ainh-A01干預(yù)

8、各組PASMCs24 h后遷移細(xì)胞數(shù)比較，正常干預(yù)組細(xì)胞遷移數(shù)（n）(63.00±8.49)、假手術(shù)干預(yù)組細(xì)胞遷移數(shù)(n)(64.00±8.83)，分別較正常不干預(yù)組(86.25±4.40)、假手術(shù)不干預(yù)組(86.25±4.57)均減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而模型干預(yù)組細(xì)胞遷移數(shù)(n)(72.25±9.05)，較不干預(yù)組(135.75±6.23)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。同時(shí)模型組抑制率（%）（46.7

9、8±6.31），較正常組（%）（27.10±7.64）、假手術(shù)組（%）（25.92±8.15）均顯劇升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義（P<0.01），而正常組和假手術(shù)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　結(jié)論：①TMEM16A在肺動(dòng)脈高壓大鼠PASMCs上表達(dá)增高，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖和細(xì)胞遷移可能參與肺血管重塑及高肺血流性肺動(dòng)脈高壓的形成。②通過(guò)抑制TMEM16A活性，T16Ainh-A01對(duì)高肺血流性肺動(dòng)脈高壓大鼠PASMCs增殖和