衣霉素激活心肌細胞氯通道的電生理特性及與ROS的關系.pdf

1、由于心肌的不可再生性,使得如何減少疾病狀態(tài)下心肌細胞的損失成為研究的焦點。而凋亡被認為是多種心臟疾病過程中,心肌細胞死亡的重要形式。目前研究表明心肌細胞凋亡時,隨著細胞內K+、Cl-和水的外流,細胞會發(fā)生皺縮,這一現(xiàn)象被稱為凋亡性容積減小(apoptoticvolumedecrease,AVD)[1]。而在AVD過程中,容積敏感外向整流氯離子通道(volume-sensitivechloridechannel,VSOR)被認為是負載氯離

2、子外流的主要通道,該通道電流又稱為容積敏感氯電流(volume-sensitiveCl-current,ICl,Vol)[1],其電生理學特征主要包括:?外向整流;?高正電壓依賴性失活;?對氯通道阻斷劑DIDS敏感。目前有關細胞凋亡的途徑一共有三條,分別為①線粒體途徑;②死亡受體途徑;③內質網(wǎng)應激。相關文獻報道[2],運用細胞凋亡線粒體途徑和死亡受體途徑經(jīng)典的激活劑STS和TNF-α均可以激活VSOR,同時介導STS激活VSOR電流的調

3、節(jié)分子為活性氧(ROS)。然而,凋亡的另一條重要途徑,內質網(wǎng)應激(endoplasmicreticulumstress,ERS)過程中是否有VSOR的參與,目前尚未見有相關文獻報道。我們前期發(fā)現(xiàn),VSOR通道的阻斷劑4,4'-二異硫氰基芪-2,2'-二磺酸(4,4'-diisothiocyanostilbene2,2'-disulfonicacid,DIDS)可以減輕內質網(wǎng)應激的誘導劑衣霉素(Tunicamycin,Tm)造成的心肌細胞

4、凋亡。為此我們假設在內質網(wǎng)應激介導的心肌細胞凋亡過程中也許VSOR同樣發(fā)揮著重要作用。本研究正是基于前期工作的基礎上,擬應用全細胞膜片鉗技術,觀察在Tm處理心肌細胞時記錄的細胞膜電流是否符合VSOR的電生理學特征,并探討ROS是否是衣霉素激活VSOR的調節(jié)分子。
　　研究目的:
　　1.觀察衣霉素是否能夠誘導心肌細胞產(chǎn)生電生理學特征符合VSOR的氯電流。
　　3.觀察在衣霉素激活心肌細胞膜VSOR電流中是否有ROS的參

5、與。
　　研究方法:
　　1.原代心肌細胞的培養(yǎng)及分組:常規(guī)獲取SD大鼠新生鼠(0-3Day)心肌細胞,進行原代爬片培養(yǎng)心肌細胞12小時,供膜片鉗使用。實驗設立陰性對照組(等滲組),正常對照組(低滲組),以及實驗組(等滲+Tm組)每組相同實驗重復5個細胞及以上。
　　2.膜片鉗全細胞電生理技術:應用膜片鉗全細胞技術觀察低滲及含Tm的等滲外液灌流細胞時,進行電流的記錄及觀察其電生理學特征。
　　3.ROS的干預:利

6、用ROS的清除劑NAC預處理后觀察Tm對心肌細胞誘導VSOR電流的影響及H2O2處理心肌細胞后,觀察心肌細胞膜電流的改變。
　　研究結果:
　　1.低滲外液灌流心肌細胞發(fā)現(xiàn)全細胞氯電流的幅度明顯增加,+100mv時的電流密度為12.22±1.31pA/pF(n=5,P<0.05,低滲組vs等滲組),且存在正電壓依賴性失活的特征。同時,I-V關系曲線表明其具有較顯著的外向整流的特征。當?shù)蜐B誘導的VSOR電流達到穩(wěn)定狀態(tài)時,利用

7、含有DIDS的低滲外液灌流心肌細胞并記錄電流。發(fā)現(xiàn)DIDS可以顯著降低低滲誘導電流的幅度,在+40mv,+60mv,+80mv,+100mv時抑制作用最為明顯,同時I-V曲線顯示其外向整流的特征被減弱了,以上電生理學特征均符合VSOR。
　　2.與等滲外液灌流誘導的低幅度基礎氯電流相比,當用含有Tm的等滲外液灌流心肌細胞同樣可以顯著地增加氯電流的幅度,+100mv時電流密度為13.26±1.15pA/pF(n=5,P<0.05,衣

8、霉素組vs等滲組),并且表現(xiàn)出較明顯的正電壓依賴性失活,以及外向整流的特征。從I-V曲線可以看出在+40、+60、+80及+100mv時電流幅度增加尤甚。而DIDS同樣可以顯著的抑制該電流的幅度以及相關電生理特征。證明Tm可以激活心肌細胞上的全細胞氯電流的電生理學特征與低滲誘導的VSOR電流類似。
　　3.利用含有NAC(10mmol)的等滲外液灌流細胞,可以發(fā)現(xiàn)僅有幅度較小的基礎電流。然而,當使用含有NAC+Tm的等滲灌流液灌流

9、細胞時卻未發(fā)現(xiàn)全細胞氯電流幅度的明顯增加(n=5,P<0.05,NAC+TmvsTm)。表明NAC可以顯著地抑制Tm誘導的VSORCl-電流的產(chǎn)生。細胞外應用H202可以直接激活Cl-電流,+100mv時電流密度為13.99±1.23pA/pF(n=5,P>0.05,TmvsH202),同Tm以及低滲誘導的Cl-電流特征相似。提示ROS參與了Tm誘導的VSOR激活。
　　結論:
　　1.低滲可以誘導心肌細胞產(chǎn)生VSOR電流,