中藥單體黃芩苷對衣霉素誘導內質網(wǎng)應激性心肌細胞損傷的影響.pdf

1、追溯中草藥發(fā)展,在我國已經(jīng)歷了幾千年的歷史長河,是我國寶貴的純天然資源,目前種類已達12807種[1]。近年來,隨著化學、生物學、藥理學和藥物分析學等現(xiàn)代學科的進步,多學科、多技術對中藥的研發(fā)取得了長遠的發(fā)展。特別是大量中草藥成分的分離、提純,藥物效應學和藥物代謝學研究進展,多種中藥單體及復合物成份廣泛應用于臨床疾病的治療,發(fā)揮著重要的藥理作用。因此,中藥單體的制備及研發(fā)成為中藥現(xiàn)代發(fā)展的潮流,如何從眾多繁雜的大量中草藥中分離出不同有效

2、的單體成分、以及從大量單體庫中篩選出具有良好藥理作用的單體成分,是現(xiàn)代藥物研發(fā)的重要方向。目前,部分中藥單體成分已被證實具有改善心腦供血、減輕缺血性損傷、抗凋亡等作用應用于臨床[2,3]。課題組前期已經(jīng)證實了氯離子通道參與了細胞凋亡的過程,阻斷其通道能夠有效抑制凋亡的發(fā)生[4],為此我們在積極尋找具有氯離子通道阻斷作用的中藥單體成分,進行前期探討。內質網(wǎng)(Endoplasmic Reticulum,ER)是真核細胞重要的細胞器,它由封閉

3、的膜系統(tǒng)及其圍成的腔形成互相溝通的網(wǎng)狀結構,參與了新生肽鏈的折疊、合成及蛋白質運輸?shù)裙δ?。研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖能量不足、病毒感染等各種刺激都會影響內質網(wǎng)的穩(wěn)態(tài),破壞蛋白質的加工及出現(xiàn)鈣耗損;衣霉素、膽固醇的積累通過破壞內質網(wǎng)平衡引起內質網(wǎng)應激性細胞凋亡[5,6]。在缺血再灌注損傷、動脈粥樣硬化、高血壓、心肌梗死及心力衰竭等心血管疾病均有ER應激的廣泛參與[7-10]。內質網(wǎng)應激發(fā)生后,通過感應調節(jié)分子伴侶GRP78表達,CHOP、磷酸化JNK

4、的上調引起細胞凋亡發(fā)生[11]。黃芩苷(Baicalin,BC)是一種黃酮類化合物,為一種功效廣泛中藥單體。BC具有抗氧化、抗凋亡、抗炎等細胞保護作用[12]。BC是否能作用于心肌細胞,與細胞膜受體結合?BC是否具有抑制ERS的功效而發(fā)揮細胞的保護作用?目前不得而知,尚未任何研究報道。為此,本研究旨在前期研究基礎上應用高通量細胞膜色譜法對部分中藥單體成分進行初步篩查,獲得能夠與細胞膜結合穩(wěn)定的中藥單體為候選成分。在此基礎上探討黃芩苷在衣

5、霉素誘導內質網(wǎng)應激性心肌細胞損傷中的作用及可能的機制。
　　研究目的:
　　1.應用高通量細胞膜色譜法觀察部分中藥單體是否與細胞膜受體穩(wěn)定結合。
　　2.探討黃芩苷對衣霉素誘導內質網(wǎng)應激性心肌細胞損傷的影響及機制。
　　研究方法:
　　1.細胞培養(yǎng)采用生物學特性穩(wěn)定的原代培養(yǎng)法并合理性分組:常規(guī)獲取SD大鼠新生鼠(0-3 Day)心肌細胞,進行原代爬片培養(yǎng)心肌細胞12小時,提供實驗用。
　　2.生物親

6、和色譜技術:細胞膜色譜法觀察作用于細胞生物膜的45種中藥單體成分與細胞膜受體的結合。采用原代細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)適量細胞,經(jīng)過多種程序逐步溶解細胞得到完整的細胞膜,隨后將制備好的細胞膜固定到活性硅膠上,裝柱得到穩(wěn)定活性的細胞膜色譜柱,在流動相為水介質、流速0.2mL/min條件下,DAD檢測,經(jīng)過光電信號轉化,出現(xiàn)色譜圖,根據(jù)出現(xiàn)峰值時間可以判斷單體與細胞膜受體結合程度。
　　3.黃芩苷對衣霉素誘導內質網(wǎng)應激性心肌細胞損傷的影響,分組設

7、立對照組、Tm組、Tm+BC組和BC組。MTT法檢測心肌細胞存活率,LDH檢測細胞損傷程度,TUNEL檢測細胞凋亡,Western blot檢測CHOP、caspase-3、磷酸化JNK蛋白水平。
　　研究結果:
　　1.利用生物親和色譜技術細胞膜色譜法從45種中藥單體中僅觀察到6種中藥單體成分能作用于細胞膜受體。它們分別是:黃芩苷、6-姜酚、白屈菜紅堿、延胡索乙素、白花前胡甲素和槐定堿。其中中藥單體黃芩苷能穩(wěn)定的與細胞膜受

8、體結合,是6個單體中唯一具有心血管藥物效應的中藥單體,為此,以它為觀察目標藥物進行進一步研究。
　　2.Tm能夠損傷心肌細胞呈現(xiàn)明顯的時間依賴關系。與對照組相比,濃度為100ng/mL衣霉素分別作用于48h、72h、96h時心肌細胞存活率分別是80％、60%、50%,差異顯著,有統(tǒng)計學意義(P<0.05),細胞損傷性指標LDH顯著增加,分別是38%、57%、60%,差異顯著,有統(tǒng)計學意義(P<0.05);同時結合內質網(wǎng)應激伴侶蛋白

9、CHOP的表達及細胞凋亡TUNEL水平變化,提示衣霉素激活了內質網(wǎng)應激并導致了細胞凋亡的發(fā)生,100 ng/ml、作用72小時為衣霉素內質網(wǎng)應激性凋亡模型的實驗條件,成功構建了衣霉素誘導的凋亡細胞模型。
　　3.與Tm組相比,BC預處理組呈現(xiàn)明顯的量效關系。細胞存活率在BC預處理不同濃度組中25μmol/L、50μmol/L與100μmol/L分別是65%、80%、85%,提示BC處理能夠顯著抑制Tm對心肌細胞的損傷,使心肌細胞存

10、活率增加(P<0.05)。加用濃度為25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L黃芩苷處理后細胞損傷性指標LDH含量分別是45%、38%、36%,提示BC處理能夠顯著抑制Tm對心肌細胞的損傷,起到保護細胞的作用;同時,BC預處理不同濃度組呈現(xiàn)明顯的抑制Tm誘導心肌細胞凋亡蛋白caspase-3、磷酸化JNK、CHOP的表達(P<0.05),使細胞凋亡的TUNEL水平明顯下調(P<0.05),呈現(xiàn)明顯的量效關系。
　　結論