衣霉素誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的胃癌BGC823細(xì)胞凋亡.pdf

1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成及合成后折疊、聚集的場(chǎng)所,也是調(diào)節(jié)和貯存細(xì)胞鈣水平的重要場(chǎng)所。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)是由于未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)累積或內(nèi)環(huán)境的Ca2+濃度的改變導(dǎo)致了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)和功能的失衡引起的。
　　在這種情況下,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的反應(yīng)以特定蛋白質(zhì)的改變?yōu)樘卣?翻譯速率的下調(diào);內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白的表達(dá)上調(diào);錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的降解。一般情況下,這一系列反應(yīng)能成功恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)環(huán)境平衡

2、。但是,在多細(xì)胞動(dòng)物里,持久或者強(qiáng)烈內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。缺氧和未正確折疊蛋白在腔內(nèi)聚集以及胞漿Ca2+失衡均可以導(dǎo)致其紊亂,從而誘發(fā)一系列相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)和細(xì)胞表型改變,稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)決定應(yīng)激細(xì)胞的結(jié)局如抵抗、適應(yīng)、損傷或凋亡有重要作用。蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔形成空間結(jié)構(gòu)由許多分子伴侶蛋白協(xié)助,其中最主要的是葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)GRP家族的GRP78/BIP,對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用,恢復(fù)蛋白質(zhì)正確構(gòu)像;同時(shí),轉(zhuǎn)錄

3、因子ATF6及跨膜蛋白激酶PEKR的活化可誘發(fā)一系列內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。其中GADD153/CHOP基因的編碼蛋白可降低Bcl-2表達(dá)、使細(xì)胞谷胱甘肽耗竭引起細(xì)胞凋亡。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)或強(qiáng)烈,還將活化定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的半胱天冬酶-12,繼而引起半胱天冬酶級(jí)聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。CHOP是作為一個(gè)C/EBPs(CCAAT/enhancer binding proteins)被發(fā)現(xiàn)的,也叫生長(zhǎng)停滯和DNA損傷誘導(dǎo)基因1

4、53即GADD153(growth arrest and DNAdamage-153),分子量約為27kDa,在人類有169個(gè)氨基酸殘基,在嚙齒類動(dòng)物有168個(gè)氨基酸殘基,GADD基因是有遺傳毒性應(yīng)激和生長(zhǎng)停滯信號(hào)誘導(dǎo)的一組基因。有三個(gè)不同的GADD基因,但是他們之間又沒有相似性。C/EBPs組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄蛋白家族,與其他蛋白質(zhì)因子一起組成復(fù)雜精細(xì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),在細(xì)胞增殖、分化、信號(hào)傳導(dǎo)、腫瘤發(fā)生以及機(jī)體的免疫、應(yīng)激反應(yīng)、能量代謝、血液生成

5、等方面發(fā)揮重要作用。正常情況下,凋亡促進(jìn)因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白CHOP(C/EBP-homologous protein)即C/EBP同源蛋白表達(dá)量十分低。但是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的情況下,表達(dá)量則顯著增加。所以CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的一個(gè)金標(biāo)準(zhǔn)。國(guó)內(nèi)外研究證明了TM在神經(jīng)系統(tǒng)、胰腺細(xì)胞等中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。但尚未見到在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡的相關(guān)報(bào)道。我們用10μg/ml的TM分別以不同的時(shí)間胃癌BGC823細(xì)胞,

6、從基因水平和蛋白表達(dá)水平檢測(cè)TM誘導(dǎo)胃癌BGC823細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,從而證明TM能否誘導(dǎo)胃癌BGC823細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　方法:
　　(1)體外培養(yǎng)胃癌BGC823細(xì)胞,在生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期用10μg/ml的TM分別處理0h、24h、36h、48h誘導(dǎo)胃癌BGC823細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
　　(2)活體培養(yǎng)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的變化、Annexin V-PI染色法檢測(cè)凋亡觀察胃癌BGC823表面形態(tài)的變

7、化了解TM的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。
　　(3)分別于0h、24h、36h和48h終止作用,RT-PCR技術(shù)檢測(cè)TM作用前后CHOP-mRNA表達(dá)的變化。
　　(4)應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)CHOP蛋白在TM誘導(dǎo)前后表達(dá)水平的變化,從蛋白水平反映CHOP與誘導(dǎo)胃癌BGC823細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的關(guān)系。
　　(5)所得結(jié)果運(yùn)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包處理,統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((?)±s)表示。以α=0.

8、05為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果:
　　(1)TM作用后,胃癌BGC823細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)呈細(xì)胞密度和聚集程度均下降,幾個(gè)細(xì)胞散在生長(zhǎng)多見,細(xì)胞體積縮小變圓且胞間距增大,細(xì)胞大小相差懸殊不大,胞質(zhì)顆粒感增強(qiáng),胞膜出芽脫落成大小不等的凋亡小體等改變。
　　(2)Annexin V-PI染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示,TM作用后,熒光顯微鏡下示綠色熒光細(xì)胞為凋亡細(xì)胞,紅色熒光細(xì)胞為死亡細(xì)胞。隨著處理時(shí)間的增加,凋亡細(xì)胞也增多。

9、r>　　(3)TM誘導(dǎo)胃癌BGC823細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)凋亡得過程中出現(xiàn)了CHOP的表達(dá),且CHOP-mRNA表達(dá)水平存在時(shí)間依賴性。在一定得條件下,隨著處理時(shí)間增長(zhǎng),表達(dá)量也增加。
　　(4)Western-blot結(jié)果顯示TM誘導(dǎo)胃癌BGC823細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)凋亡得過程中出現(xiàn)了CHOP的表達(dá),且CHOP蛋白水平表達(dá)存在時(shí)間依賴性。在一定得條件下,隨著處理時(shí)間增長(zhǎng),表達(dá)量也增加。
　　結(jié)論:
　　TM可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)