異牛肝菌素誘導人胃癌細胞BGC-823凋亡的機制研究.pdf

1、目的:胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，在我國其發(fā)病率與死亡率高居各種惡性腫瘤的前列。目前，胃癌的治療包括手術(shù)、放療、常規(guī)化療、分子靶向治療和生物治療等。盡管如此，胃癌經(jīng)過治療后，其五年生存率仍然小于20％。
　　眾所周知，臨床上采取的放、化療會產(chǎn)生嚴重的副作用。因此，尋找有效治療惡性腫瘤而且毒副作用小的藥物是目前醫(yī)藥工作者的迫切任務。近些年的研究工作表明，一些來自植物和真菌的代謝產(chǎn)物是這類藥物的首選。一項研究報告表明1981-2002

2、年間注冊的65種抗癌藥物中有48種是從天然產(chǎn)物中獲得的。目前，從大型真菌中提取活性成分用于臨床腫瘤的治療是新藥開發(fā)途徑之一。
　　異牛肝菌素(iso-suillin)，是由褐環(huán)粘蓋牛肝菌(Suillus luteus)子實體中得到的一種化合物，分子量為440.29，化學名為3，6-二羥基-[(2E，6E，10E)-3，7，11，15-六甲基十六碳-2，6，10，14-四烯]苯乙酯，是粘蓋牛肝菌素suillin的同分異構(gòu)體，屬于聚異

3、戊二烯酚類化合物。近年來研究發(fā)現(xiàn)，iso-suillin能夠明顯抑制腫瘤細胞活性。
　　本實驗旨在觀察iso-suillin對人胃癌細胞BGC-823增殖和凋亡的影響，并研究其誘導凋亡的分子機制。
　　方法:
　　1、細胞培養(yǎng):BGC-823細胞以RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，內(nèi)含10％胎牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素100μg/ml，置37℃、5％ CO2環(huán)境下培養(yǎng)。
　　2、MTT檢測iso-suill

4、in對BGC-823細胞的抑制作用:不同濃度的iso-suillin（0、3.5、7、14、28、56、112μmol/L）分別作用于對數(shù)生長期的BGC-823細胞24、48和72 h。定時檢測細胞生長情況，每孔加入5 mg/mlMTT20μl，繼續(xù)孵育4 h，離心吸去上清，加入二甲基亞砜(Dimethyl-sulfoxide，DMSO)裂解細胞。用酶標儀測490nm波長吸光值（A值），計算抑制率:抑制率(％)=[（對照組A-實驗組A）

5、/對照組A]×100％。得出iso-suillin作用的半數(shù)抑制濃度(IC50)。
　　3、細胞形態(tài)學觀察:BGC-823細胞種于6孔板后用不同濃度的iso-suillin處理48 h。(1)在光學顯微鏡下觀察iso-suillin對BGC-823細胞形態(tài)的影響。(2)熒光顯微鏡(Olympus，Japan)觀察記錄細胞形態(tài)變化。(3)采用透射電子顯微鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)變化。
　　4、流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率:細胞經(jīng)藥物作用

6、后，經(jīng)PBS沖洗，70％乙醇固定，50μg/ml碘化丙錠(propidium iodide，PI)染色30 min后，采用流式細胞儀分析。
　　5、蛋白印記檢測相關(guān)蛋白表達:收集人胃癌BGC-823細胞，加入細胞裂解液提取蛋白，之后用試劑盒測定蛋白濃度。樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳、硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移、5％脫脂奶粉封閉、經(jīng)一抗和二抗作用、ECL顯影，用凝膠圖像分析系統(tǒng)測定目的蛋白的光密度值，并與相對應的β-actin條帶光密度比較，計

7、算表達量。
　　6、統(tǒng)計學方法:所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（(x)±s）表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計，作單因素方差分析(One-Way ANOVA)，P＜0.05為有顯著差異。
　　結(jié)果:
　　1、MTT法:實驗結(jié)果顯示，相同濃度的iso-suillin作用于BGC-823細胞后，其抑制率隨時間的延長而增大。而在處理時間相同時，隨藥物濃度越高，其抑制率越大。
　　2、形態(tài)學的改變:(1)光鏡結(jié)果顯示，隨

8、著iso-suillin濃度的增加，細胞變小變圓，與周圍細胞鏈接消失，脫壁，漂浮細胞增多。(2) DAPI染色后經(jīng)熒光顯微鏡下觀察結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增加，BGC-823細胞出現(xiàn)細胞核固縮、染色質(zhì)濃縮以及核碎裂等細胞凋亡的現(xiàn)象。(3)電鏡結(jié)果顯示，iso-suillin處理后細胞可見核染色質(zhì)濃縮，邊集于核膜下;細胞質(zhì)也高度濃縮，體積縮小，電子密度增加。
　　3、流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率:結(jié)果顯示，不同藥物濃度的處理組均出現(xiàn)凋亡

9、峰，與對照組相比，處理組凋亡峰隨著藥物濃度的增加越來越明顯。對照組及8、16、32μmol/L藥物濃度處理組凋亡率分別是:（0.97±0.3）％、(14.18±1.2)％、（38.34±2.3）％、（50.72±1.7）％，實驗組與對照組差異明顯（P＜0.01）。
　　4、Iso-suillin對BGC-823細胞凋亡相關(guān)蛋白的影響:結(jié)果顯示BGC-823細胞經(jīng)0、8、16、32μmol/L iso-suillin處理48 h后，

10、Caspase-3,Caspase-8，Caspase-9的表達產(chǎn)物隨著iso-suillin處理濃度的增大，條帶明顯變寬、變深。統(tǒng)計結(jié)果顯示:經(jīng)iso-suillin處理后細胞中Caspase-3、-8、-9蛋白表達增高，與對照組細胞相比差異明顯(P＜0.05)。
　　5、Iso-suillin對BGC-823細胞自噬體形成的影響
　　透射電鏡結(jié)果顯示:對照組細胞器形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，未見自噬體。與對照組相比，經(jīng)iso-suil