shRNA-FHIT對胃癌細(xì)胞株BGC-823增殖和凋亡的影響.pdf

1、背景和目的:胃癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，與環(huán)境致癌物密切相關(guān)，在我國無論發(fā)病率還是死亡率都很高，嚴(yán)重威脅人類健康。我國早期胃癌的檢出率較低，僅為10％左右，多數(shù)病例在確診時(shí)已屬中晚期，中晚期胃癌患者的治療效果差，五年存活率僅為20％～30％，故胃癌的早期診斷和綜合治療是提高療效的關(guān)鍵所在。胃癌的發(fā)生具有多階段、多因素的特征，在此過程中涉及癌基因的突變和活化、抑癌基因的丟失或表達(dá)失調(diào)以及凋亡調(diào)節(jié)機(jī)制紊亂等遺傳學(xué)改變。脆性組氨酸三聯(lián)體.

2、(fragile histidine triad.FHIT)基因是1996年Ohta等人在研究某家族性腎細(xì)胞癌時(shí)利用外顯子捕獲的方法發(fā)現(xiàn)的，并克隆了相應(yīng)的cDNA。因其覆蓋腎細(xì)胞癌相關(guān)性斷裂點(diǎn)t(3；8)及主要的脆性位點(diǎn)FRA3B，且蛋白產(chǎn)物從屬于組氨酸三聯(lián)體(histidinetriad，HIT)蛋白超家族，故命名。大量研究顯示，F(xiàn)HIT基因是第一個(gè)將脆性位點(diǎn)和腫瘤聯(lián)系起來的抑癌基因。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HIT基因在胃癌等與環(huán)境致癌因素關(guān)系密

3、切的惡性腫瘤中表達(dá)缺失和異常率較高，這些均提示FHIT在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及治療中可能扮演重要的角色。FHIT基因及其基因產(chǎn)物的抑癌機(jī)制目前尚不十分清楚，F(xiàn)HIT很可能從多條途徑發(fā)揮腫瘤抑制作用。對FHIT作用及機(jī)制的深入研究可能為胃癌的診斷和治療提供新的思路。我們既往研究發(fā)現(xiàn)，外源性FHIT基因轉(zhuǎn)染可以提高胃癌細(xì)胞MGC-803對順鉑(DDP)和阿霉素(ADM)的敏感性、降低對5-氟尿嘧啶(5-FU)的敏感性；FHIT基因表達(dá)與阿霉素協(xié)

4、同促進(jìn)MGC-803細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯，因此，胃癌患者自然狀態(tài)下FHIT基因陽性與陰性表達(dá)的不同是否可導(dǎo)致化療敏感性的差異應(yīng)引起高度關(guān)注。RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)是近年來出現(xiàn)的一種高效地特異性封閉基因的新技術(shù)，無論在功能基因組研究還是腫瘤的基因治療等方面得到廣泛的應(yīng)用。基于此，本研究通過構(gòu)建靶向抑制脆性組氨酸三聯(lián)體基因的短發(fā)夾雙鏈RNA(shRNA-FHIT)真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染入胃癌細(xì)胞株BGC-

5、823，篩選獲得FHIT穩(wěn)定低表達(dá)細(xì)胞模型，并觀察FHIT基因抑制后對胃癌細(xì)胞株BGC-823增殖和凋亡的影響，為進(jìn)一步研究其對胃癌化療敏感性的影響奠定生物學(xué)基礎(chǔ)并提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：構(gòu)建FHIT基因特異性的小RNA干擾質(zhì)粒PGPU6/GFP/Neo-shRNA1、PGPU6/GFP/Neo-shRNA2，利用脂質(zhì)體LipofactamineTM2000轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株BGC-823，實(shí)驗(yàn)分為未轉(zhuǎn)染組、陰性對照組（轉(zhuǎn)染PG

6、PU6/GFP/Neo-shNC組）及PGPU6/GFP/Neo-shRNA1轉(zhuǎn)染組和PGPU6/GFP/Neo-shRNA2轉(zhuǎn)染組，G418篩選得到穩(wěn)定表達(dá)株，Real-time PCR檢測在mRNA水平干擾質(zhì)粒對FHIT的抑制效應(yīng)，MTT法、流式細(xì)胞術(shù)觀察轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞生長特性的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功將含靶向FHIT基因的短發(fā)夾雙鏈RNA(shRNA)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染FHIT表達(dá)陽性的胃癌細(xì)胞株BGC-82

7、3，經(jīng)G418壓力培養(yǎng)3個(gè)月后，獲得穩(wěn)定表達(dá)shRNA-FHIT的克隆。
　　 2.轉(zhuǎn)染shRNA-FHIT重組質(zhì)粒的BGC-823細(xì)胞FHITmRNA表達(dá)明顯下降，與陰性對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　 3.轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒組細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)，凋亡率減低，與未轉(zhuǎn)染組和陰性對照組相比，生長周期出現(xiàn)S期和G2/M期的比例上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功