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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:通過構(gòu)建攜帶有NM23基因的重組腺病毒載體并加以鑒定,包裝腺病毒并感染人胃癌細(xì)胞株BGC-823,觀察其對(duì)人胃癌細(xì)胞株BGC-823細(xì)胞凋亡的影響,從而建立表達(dá)NM23基因的人胃癌細(xì)胞株BGC-823。
方法:⑴以質(zhì)粒NM23-PIRES2-EGFP為模版,采用PCR法擴(kuò)增出NM23基因,克隆至腺病毒載體 pCMV-MCS-IRES-EGFP上,形成重組腺病毒載體pCMV-NM23-IRES-EGFP并酶切鑒定及基因測(cè)序
2、;⑵包裝病毒并檢測(cè)其滴度,確定腺病毒感染人胃癌細(xì)胞株BGC-823的最佳MOI值。⑶將人胃癌細(xì)胞株BGC-823分為實(shí)驗(yàn)組(NM23-OE組,感染pCMV-NM23-IRES-EGFP)、空白組(Ctrl組),陰性對(duì)照組(NC組,感染pCMV-MCS-IRES-EGFP)。⑷分別用Real Time PCR和Western Blot檢測(cè)3組細(xì)胞中NM23基因mRNA和蛋白表達(dá)。⑸通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)3組胃癌細(xì)胞株BGC-823的凋亡率。<
3、br> 結(jié)果:①經(jīng)酶切鑒定和基因測(cè)序證實(shí)成功構(gòu)建重組腺病毒pCMV-NM23-IRES-EGFP;②經(jīng)擴(kuò)增后,重組腺病毒的滴度為4.0x1010 ifu/mL;③Real Time PCR和Western Blot結(jié)果顯示:陰性對(duì)照組與空白組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而實(shí)驗(yàn)組的NM23的mRNA和蛋白表達(dá)顯著高于其他兩組(P<0.05);④實(shí)驗(yàn)組BGC-823細(xì)胞的凋亡率也顯著高于其他兩組(P<0.05)。
結(jié)論
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