華蟾素調(diào)控mir-494促胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡作用機(jī)制的實驗研究.pdf

1、研究目的:
　　蟾蜍自古就被作為攻毒類中藥在抗腫瘤方面發(fā)揮重要作用。而自中華大蟾蜍陰干的蟾皮中提取的華蟾素注射液在臨床被廣泛應(yīng)用于抗腫瘤治療，并得到臨床驗證。對華蟾素作用機(jī)制的研究頗多，基本局限在mRNA及蛋白水平，尚不能作為靶標(biāo)指導(dǎo)臨床何時使用華蟾素有效。而miRNA是調(diào)控mRNA及其所表達(dá)蛋白的上游基因，許多研究推測miRNA可作為腫瘤治療的靶點(diǎn)，故本研究旨在探討miRNA參與華蟾素抑制胃癌細(xì)胞增殖促凋亡的機(jī)制，從而找出華蟾素

2、作用靶點(diǎn)，以期指導(dǎo)臨床個體化用藥。
　　研究方法:
　　應(yīng)用MTT法及流式細(xì)胞術(shù)等，檢測華蟾素抑制人胃癌BGC-823細(xì)胞增殖的抑制率及促凋亡率率，證實華蟾素的有效作用后，采用基因芯片技術(shù)分析得華蟾素作用于BGC-823細(xì)胞48小時后miRNAs表達(dá)的變化譜，并獲得一些候選的miRNAs分子，再對這些分子用實時定量PCR法檢測其表達(dá)變化與對照組（生理鹽水）的差別，而獲得最顯著差異表達(dá)的miRNA分子(miR-494)。

3、>　　將miR-494 mimics轉(zhuǎn)染到BGC-823細(xì)胞，并用實時定量PCR法檢測轉(zhuǎn)染miR-494mimics后BGC-823細(xì)胞中miR-494表達(dá)量的變化以驗證轉(zhuǎn)染效果。再用細(xì)胞增殖試驗（CCK法）及流式細(xì)胞術(shù)分析轉(zhuǎn)染miR-494 mimic滿意的BGC-823細(xì)胞較對照組增殖及凋亡情況;生物信息學(xué)軟件TargetScan，PicTar，and Miranda預(yù)測miR-494下游靶基因(BAG-1);Western-blo

4、t法檢測轉(zhuǎn)染miR-494 mimic后BGC-823細(xì)胞中BAG-1表達(dá)情況。用miR-494 mimics轉(zhuǎn)染293T（人T抗原腎上皮細(xì)胞）細(xì)胞后與BAG-1培養(yǎng)，雙熒光素酶試驗檢測轉(zhuǎn)染miR-494 mimic后，BAG-1的表達(dá)與轉(zhuǎn)染miR-494 mimic的關(guān)系，從而證實miR-494與BAG-1之間有否靶向關(guān)系。
　　實驗結(jié)果:
　　1)隨著藥物質(zhì)量濃度的增加，華蟾素對人胃癌BGC-823細(xì)胞的生長抑制作用明顯

5、增強(qiáng)，具有劑量、時間相關(guān)性。提示50mg/ml濃度72小時組對癌細(xì)胞抑制率最高46.35％，與其他濃度組及紫杉醇陽性對照組比較統(tǒng)計學(xué)有顯著意義(P＜0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測華蟾素對BGC-823細(xì)胞作用48小時后細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果50mg/ml濃度組凋亡率為34.5±1.3，與對照組相比，差異具有顯著性(P＜0.05)。說明華蟾素可以抑制BGC-823細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡。
　　2)華蟾素處理人胃癌細(xì)胞BGC-823細(xì)胞系4

6、8h后，與生理鹽水對照組相比，共得到527個miRNAs表達(dá)變化的miRNAs表達(dá)譜，其中33個miRNA表達(dá)上調(diào)1.5倍以上，12個miRNA表達(dá)下調(diào)1.5倍以下。篩選后實時定量PCR驗證12個miRNA分子(hsa-miR-181c-3p、hsa-miR-20b-5p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-29a、hsa-miR-502-3p、hsa-miR-107、hsa-miR-299-3p、hsa-miR-493、hs

7、a-miR-301a-3p、hsa-miR-494、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-454-3p)得到:miR-494是與華蟾素最顯著上調(diào)的miRNA分子。
　　3)將miR-494 mimics轉(zhuǎn)染到BGC-823細(xì)胞后培養(yǎng)，用實時定量PCR法檢測轉(zhuǎn)染miR-494 mimics后BGC-823細(xì)胞中miR-494表達(dá)量的變化，結(jié)果隨時間達(dá)72小時miR-494呈過表達(dá)狀態(tài)，說明轉(zhuǎn)染效果好。被轉(zhuǎn)染miR-494 m

8、imics的BGC-823細(xì)胞系培養(yǎng)，細(xì)胞增殖試驗（CCK法）及流式細(xì)胞術(shù)分析與對照組相比可以顯著抑制BGC-823細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。
　　4)生物信息學(xué)方法預(yù)測BAG-1是miR-494下游靶基因，其3'UTR區(qū)存在miR-494結(jié)合區(qū)域。
　　5)Western-blot法檢測BAG-1，與對照組及轉(zhuǎn)染NC mimic后的BGC-823細(xì)胞中BAG-1表達(dá)量相比，轉(zhuǎn)染miR494后BCG-823細(xì)胞中BAG-

9、1表達(dá)量顯著下降（*p＜0.05）。雙熒光素酶試驗檢測轉(zhuǎn)染miR-494 mimic后的293T細(xì)胞與BAG-1培養(yǎng)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-494mimic后BAG-1顯著下調(diào)，即miR-494上調(diào)時BAG-1下調(diào)。
　　結(jié)論:
　　華蟾素抑制人胃癌BGC-823細(xì)胞增殖過程中伴隨miRNAs表達(dá)譜的變化，華蟾素可能是通過誘導(dǎo)miR-494作用于BAG-1蛋白而參與抑制胃癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用的。所以，我們推測miR-4