半夏瀉心湯對S-,180-小鼠和人胃癌BGC-823細胞的作用及其機制研究.pdf

1、目的：通過體內(nèi)實驗探討半夏瀉心湯對荷瘤昆明小鼠S瑚的抑制作用及其作用機制；并通過體外實驗探討半夏瀉心湯大鼠含藥血清對人胃癌BGC-823細胞的增殖抑制作用及其機制，進而探討其用于胃癌治療的可行性。 方法：1動物實驗：選擇雄性清潔級昆明小鼠50只，將經(jīng)小鼠腹腔傳代的S<,180>細胞，調(diào)整濃度至1×10<'7>個/ml，取細胞懸液0.2ml，接種于小鼠右上肢腋部皮下。于接種次日將其隨機分成5組：空白對照組、半夏瀉心湯低劑量組(1g

2、/ml)、半夏瀉心湯中劑量組(2g/ml)、半夏瀉心湯高劑量組(3g/ml)及環(huán)磷酰胺組，每組10只。空白對照組灌服生理鹽水，各中藥組分別灌服三個不同劑量的半夏瀉心湯，0.15ml/10g．d每日灌藥1次，共14天，環(huán)磷酰胺組給予環(huán)磷酰胺0.3mg/(10g．d)，隔日腹腔注射1次，共7次。于第15天將所有小鼠稱重后處死，立即剝瘤、取脾、稱重，計算腫瘤抑制率及脾指數(shù)。同時取瘤組織，用免疫組化法分析VEGF、Bcl-2蛋白表達情況。應(yīng)用流

3、式細胞儀測定細胞周期及凋亡并定量分析VEGF、Bcl-2蛋白表達的變化。2體外實驗：按“通法”制備低劑量(0.77g/ml)、中劑量(1.54g/ml)、高劑量(3.08g/ml)半夏瀉心湯大鼠含藥血清。然后選擇人胃癌細胞系BGC-823細胞，采用四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法檢測低、中、高三組半夏瀉心湯大鼠含藥血清、不同時間組(24h、48h、96h)對BGC-823細胞增殖的影響。應(yīng)用免疫細胞化學(xué)(immunocytochemist

4、ry)方法分析半夏瀉心湯大鼠含藥血清作用BGC-823細胞48h后VEGF、Bcl-2蛋白表達的變化。流式細胞術(shù)測定不同劑量組半夏瀉心湯大鼠含藥血清對人胃癌BGC-823細胞作用48h后的細胞周期分布及細胞凋亡的影響。應(yīng)用流式細胞儀間接免疫熒光技術(shù)分析不同劑量組半夏瀉心湯大鼠含藥血清作用于BGC-823細胞48h后 VEGF、Bcl-2蛋白表達的變化。 結(jié)果：1.動物實驗(1)于給藥結(jié)束后次日處死5組S<,180>荷瘤小鼠，稱量

5、各組的瘤重及脾重，分別計算各組的抑瘤率及脾指數(shù)。低、中、高中藥組和環(huán)磷酰組的抑瘤率依次22.2％、45.9％、57.8％、73.0％，個中藥組的抑瘤率隨半夏瀉心湯劑量的增大逐漸增加。空白對照組、低、中、高中藥組和環(huán)磷酰組的脾指數(shù)依次為8.183、8.380、8.986、9.798、8.380，高劑量中藥組的脾指數(shù)與空白對照組比較明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。(2)免疫細胞化學(xué)檢測結(jié)果顯示：空白對照組細胞中 VEGF、Bc

6、l-2染色均為陽性，細胞的胞漿或胞膜中可見棕黃色著色。各中藥組中VEGF及Bcl-2在細胞中的染色強度明顯減弱，而環(huán)磷酰胺組細胞中的VEGF、Bcl-2染色仍為陽性。(3)流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：對細胞周期的分析結(jié)果顯示：低、中、高半夏瀉心湯組與對照組相比，G<,0>/G<,1>期細胞逐漸增多，S期和G<,2>/M期細胞則逐漸減少，提示半夏瀉心湯可阻滯細胞周期于G<,0>/G<,1>期，且該作用具有劑量依賴性。瘤組織經(jīng)流式細胞術(shù)檢測凋亡

7、率結(jié)果顯示：空白對照組、中藥低、中、高三組及環(huán)磷酰胺組的凋亡百分率依次為2.52％、15.92％、23.05％、28.54％、31.34％。不同劑量中藥組和環(huán)磷酰胺組均出現(xiàn)典型的亞二倍體凋亡峰，且各中藥組隨半夏瀉心湯劑量的增大凋亡率逐漸升高。中藥各組、環(huán)磷酰胺組的凋亡率分別與空白對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。流式細胞儀間接分析細胞VEGF、Bcl-2的蛋白表達顯示：空白對照組、中藥低、中、高三組及環(huán)磷酰胺組細胞中VEG

8、F的熒光指數(shù)FI值依次為2.783、2.219、2.025、1.368和2.449?？瞻讓φ战M、中藥低、中、高三組及環(huán)磷酰胺組細胞中Bcl-2的熒光指數(shù)FI值依次為2.166、1.822、1.639、1.232和1.984。低、中、高中藥組和環(huán)磷酰胺組細胞中VEGF、Bcl-2的熒光指數(shù)FI值均較對照組減小，對于每種蛋白，分別比較各中藥組、環(huán)磷酰胺組與空白對照組的FI值，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。2體外實驗(1)MTT 比色法

9、結(jié)果顯示：低、中、高劑量半夏瀉心湯大鼠含藥血清對BGC-823細胞均具有增殖抑制作用。不同劑量組的半夏瀉心湯含藥血清處理細胞24～96h后，與對照組比較，各中藥組OD比值均有不同程度的下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。且隨半夏瀉心湯含藥血清劑量的增大、作用時間的延長，OD比值逐漸下降，即半夏瀉心湯含藥血清對BGC-823細胞的增殖抑制作用有明顯的劑量依賴性和時間依賴性，且抑制率以高劑量半夏瀉心湯含藥血清作用72h為最高，可達52

10、.9％。(2)免疫細胞化學(xué)檢測結(jié)果顯示：未經(jīng)半夏瀉心湯含藥血清處理的BGC-823細胞中 VEGF、Bcl-2染色均為陽性，細胞的胞漿或胞膜中可見棕黃色著色。而經(jīng)三個劑量組的半夏瀉心湯含藥血清處理48h后的細胞中，VEGF 及Bcl-2的染色強度均減弱。(3)流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：低、中、高劑量組半夏瀉心湯大鼠含藥血清作用BGC-823細胞48h后，隨劑量的增大，G<,0>/G<,1>期細胞逐漸增多，S期和G<,2>/M期細胞則逐漸減

11、少。提示半夏瀉心湯可阻滯BGC-823細胞周期于G<,0>/G<,1>期，該作用呈劑量依賴性。正常對照組、空白對照組、低、中、高劑量半夏瀉心湯含藥血清作用BGC-823細胞48h后各組的凋亡百分率依次為1.31％、1.66％、7.66％、13.16％和23.24％。低、中、高劑量組半夏瀉心湯含藥血清處理BGC-823細胞48h后，均出現(xiàn)典型的亞二倍體凋亡峰，且隨半夏瀉心湯劑量的加大而逐漸升高。各中藥組的凋亡率與空白對照組比較，差異具有統(tǒng)

12、計學(xué)意義(P<0.05)。流式細胞儀間接分析BGC-823細胞中VEGF、Bcl-2的蛋白表達結(jié)果顯示：正常對照組、空白對照組和中藥低、中、高半夏瀉心湯組BGC-823細胞中VEGF的熒光指數(shù)FI值依次為3.231、3.326、2.966、2.798和2.631。正常對照組、空白對照組和中藥低、中、高半夏瀉心湯組BGC-823細胞中Bcl-2的熒光指數(shù)FI值依次為3.268、3.471.、3.136、3.083和2.801。不同劑量半夏

13、瀉心湯含藥血清作用BGC-823細胞48h后，VEGF、Bcl-2的熒光指數(shù)FI值隨藥物劑量的增大而逐漸降低。對于每種蛋白，分別比較各中藥組和空白對照組的FI值，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且以高劑量組的FI值降低最為明顯。 結(jié)論：1半夏瀉心湯在一定劑量范圍內(nèi)，可抑制小鼠S<,180>腫瘤的生長并呈一定的劑量依賴性。高劑量的半夏瀉心湯可提高荷瘤小鼠的脾指數(shù)，提示半夏瀉心湯可提高荷瘤小鼠的免疫力及抗腫瘤能力。2半夏瀉心湯在

14、一定劑量范圍內(nèi)，能夠抑制BGC-823細胞增殖，并呈一定的劑量和時間依賴性。3半夏瀉心湯可將小鼠S<,180>細胞和BGC-823細胞阻滯于周期G<,0>/G<,1> 期，并可誘導(dǎo)這兩種細胞凋亡，該作用呈一定的劑量依賴性。4 半夏瀉心湯可下調(diào) VEGF和Bcl-2蛋白的表達，提示其可能通過抗血管生成、抑制細胞增殖、誘導(dǎo)凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用。5 本研究為半夏瀉心湯在抗小鼠S<,180>肉瘤、抗胃癌中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。6 本研究可能為中