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文檔簡介
1、目的:本實驗擬1、研究肝癌組織、癌旁組織和良性肝組織中TM EM16 A蛋白水平的表達差異,在肝癌組織和癌旁組織中研究TMEM16AmRN A水平表達差異;2、在肝癌細胞系SMMC-7721中轉(zhuǎn)入TMEM16 A過表達質(zhì)粒并研究TM EM16 A過表達對肝臟腫瘤細胞的增殖能力、遷移能力和凋亡能力的影響。3、研究肝癌組織和癌旁組織的TMEM16A基因啟動子CpG島甲基化程度并在SMMC-7721中研究去甲基化藥物5-氮雜-2脫氧胞苷處理對
2、TMEM16A蛋白表達水平和TMEM16AmRNA表達水平的影響。
方法:1、本課題收集青島大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽胰外科40例肝癌切除術(shù)患者的肝癌組織及其癌旁組織40對和6例肝良性病變,利用western blot方法研究TMEM16A蛋白在肝癌組織、癌旁組織和肝臟良性組織中的表達水平,利用實時熒光定量PCR方法研究TMEM16AmRNA在肝癌組織和癌旁組織中表達水平;2、通過在肝癌細胞系SMMC-7721中轉(zhuǎn)入TMEM16A過表達
3、質(zhì)粒pEGFP-TMEM16A和pcDNA3.1-TMEM16A和相應(yīng)對照空載pEGFP-N1和pcDNA3.1,使用MTT比色法、劃痕實驗法和A nne xin V& P I雙染凋亡檢測法,研究TM EM16A過表達質(zhì)粒對肝腫瘤細胞SMMC-7721增殖能力、遷移能力及細胞凋亡的影響;3、用亞硫酸氫鹽克隆測序法(Bis ul fite Sequence PCR,BSP)檢測肝癌組織和癌旁組織TMEM16A基因啟動子CpG島甲基化程度差
4、異,并使用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2脫氧胞苷處理SMMC-7721細胞,并使用實時熒光定量PCR檢測處理造成的TMEM16AmRNA變化差異,用wes tern blot檢測處理造成的TMEM16A蛋白變化差異以及用亞硫酸氫鹽克隆測序法檢測TMEM16A基因啟動子CpG島甲基化程度差異。
結(jié)果:本研究第一次證實:1、通過western blot結(jié)果顯示肝癌中TMEM16A蛋白表達水平相比于癌旁組織(P<0.01)和良性肝組織
5、(P<0.001)明顯低表達,實時熒光定量PCR結(jié)果顯示肝癌中TMEM16AmRNA表達水平相比于癌旁組織明顯低表達(P<0.001);2、通過在肝癌細胞系 SMMC-7721中轉(zhuǎn)入過表達質(zhì)粒 pEGFP-TM E M16A和相應(yīng)空載pEGFP-N1,并利用熒光顯微鏡拍照和異常細胞分析顯示TMEM16A在肝癌細胞中的過表達明顯提高了異常細胞百分比(P<0.001);3、通過在肝癌細胞系SMMC-7721中轉(zhuǎn)入TMEM16A的過表達質(zhì)粒并
6、通過MTT細胞增殖實驗、劃痕實驗和 Annexin V& PI雙染凋亡檢測可以發(fā)現(xiàn),TMEM16A的過表達明顯抑制了腫瘤細胞的增殖能力(P<0.001),并促進細胞凋亡(P<0.05),但是對腫瘤細胞的遷移能力并無明顯影響。4、亞硫酸氫鹽克隆測序?qū)嶒灲Y(jié)果證實相比于癌旁組織TMEM16A基因啟動子CpG島甲基化水平在肝癌組織中處于更高水平(P<0.05)。并且,相比于對照組的腫瘤細胞經(jīng)過去甲基化5-氮雜-2脫氧胞苷處理的SMMC-7721
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