氯離子通道TMEM16A對急性肺損傷的影響.pdf

1、目的：急性肺損傷(ALI)/急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是指由心源性以外的各種肺內(nèi)外因素導(dǎo)致的急性、進(jìn)行性呼吸衰竭。其發(fā)病急、病情重，死亡率高，臨床上主要表現(xiàn)為難治性低氧血癥、非心源性肺水腫、肺動脈高壓而體循環(huán)低血壓。其主要病理生理特點(diǎn)之一為急性肺水腫(APE)。該現(xiàn)象是指由于各種病因?qū)е鲁５囊后w積蓄于肺間質(zhì)和/或肺泡內(nèi)，形成間質(zhì)性和/或肺泡性肺水腫。而在對抗發(fā)生肺水腫的過程中，肺泡上皮細(xì)胞發(fā)揮著不可替代的作用。由于各種直接或間接的

2、作用導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞受到損傷時，其生理活性喪失：除表面活性物質(zhì)減少外，細(xì)胞正常容積發(fā)生改變，肺泡肺泡細(xì)胞膜對于液體的轉(zhuǎn)運(yùn)功能出現(xiàn)障礙，從而導(dǎo)致肺泡不能清除多余的液體導(dǎo)致水腫加重。而后兩者的作用又與肺泡細(xì)胞膜表面的離子通道有著密切的關(guān)系。
　　 在眾多的離子通道當(dāng)中，鈉通道對于肺泡液體清除的作用已經(jīng)被證實(shí)。劉琳等在其實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)了肺泡上皮細(xì)胞中存在著水通道1(AQP1)，并且其在ARDS狀態(tài)下顯著下降。而做為生物體內(nèi)含量豐富的氯離

3、子通道卻一直被人們所忽視。直到近年來人們才逐漸對氯離子通道關(guān)注起來。先后發(fā)現(xiàn)了鈣激活氯通道(Currents mediated by calcium-activated chloride channels(CaCCs))、容積（或稱體積）調(diào)控性氯通道(Volume-regulated anion channels，VRAC，ICl. swell)通道、電壓門控性氯通道(votage2gated chloride channels ClC

4、 family)、cAMP/蛋白酶激活的氯通道、配體激活的氯通道等。其功能多種多樣，其中有少數(shù)關(guān)于CFTR(cyctic fibrosis transmembrane conductance regulator)鈣激活氯離子通道在肺泡液體清除中的報道。也有容積調(diào)控性氯通道對細(xì)胞正常生理功能的維持作用。但是尚未有足夠的人重視起其在急性肺損傷過程中的作用。
　　 本課題選擇了TMEM16A作為研究的對象。因?yàn)門MEM16A是2008

5、年才被正式報道的一種新穎的鈣激活氯離子通道，主要有以下幾個特點(diǎn)：1、作用眾多。如對小鼠氣道的形成，減少氣道粘液分泌，信號傳導(dǎo)等方面均有作用，并且兼有容積調(diào)控功能。2、人體內(nèi)含量豐富，并且在多種組織表達(dá)。3、有可用的特異阻斷劑，如尼氟滅酸(NFA)，這是很多實(shí)驗(yàn)必備的條件。4、小鼠基因序列與人同源性高，達(dá)91％。5、具有其它TMEM16家族蛋白不具有的分子特性。6、有其它氯離子通道研究作為基礎(chǔ)。7、潛在的鈣激活氯通道的分子基礎(chǔ)。
　

6、　 有文獻(xiàn)證明氯離子通道在急性肺損傷時對肺泡液體清除存在著一定作用，而且在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)當(dāng)中發(fā)現(xiàn)：TMEM16A在急性肺損傷過程中，其表達(dá)量會因疾病受到影響。因此選擇復(fù)制了兩種本實(shí)驗(yàn)室相對成熟的急性肺損傷大鼠模型：大腸桿菌(E.coli)氣道注入和脂多糖(LPS)尾靜脈注射模型，分別模擬肺內(nèi)外源性急性肺損傷過程。比較兩種肺損傷發(fā)病機(jī)制以及不同肺損傷模型中肺組織TMEM16A的組織含量表達(dá)差異。
　　 方法：選取清潔級健康雄性Spr

7、ague Dawley(SD)大鼠18只，體重250±10g，將其隨機(jī)分為三組：正常對照組，LPS干預(yù)組，Ecoli干預(yù)組，各組均為6只。LPS組：經(jīng)尾靜脈注射LPS(8mg/kg)，4小時后取材。E.coli組：大腸桿菌混懸液（3ml/kg）（濃度109級）氣管內(nèi)緩慢均勻滴入，24小時后取材。造模成功后將動物以10％水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉，固定在手術(shù)臺上。股動脈放血處死后立即開胸取新鮮肺組織（右肺下葉，于冰上操作），取材

8、后立即放于已標(biāo)記好的凍存管中，轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存，留待蛋白印跡（Westem blot，以下簡稱WB）用。取右肺上葉肺組織用于濕/干重比(W/D)檢測。取右肺中葉肺組織用10％中性福爾馬林溶液固定，留做病理及免疫組織化學(xué)檢查。分離出氣管，做“T”字型倒切口，行氣管插管。用無菌生理鹽水4ml行支氣管肺泡灌洗術(shù)，使灌洗液在肺內(nèi)停留20秒左右，期間反復(fù)搖晃手術(shù)臺，使灌洗液盡可能滲透至肺泡腔內(nèi)。如此反復(fù)3次，回收灌洗液，過濾后離心(120

9、0rpm，10min)。上清液-80℃保存，留待蛋白含量測定。
　　 結(jié)果：
　　 1、WB結(jié)果正常組（1.599±0.142）及LPS組(1.652±0.036)之間無統(tǒng)計學(xué)差異，而大腸桿菌組(1.149±0.125)相比其它兩組有明顯下降。
　　 2、病理結(jié)果光鏡下肺組織病理評分LPS組(11.33±1.37)與E.coli組(11.83±0.75)均明顯高于正常組。兩模型組之間無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　

10、3、免疫組化可見肺血管平滑肌細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞特異性染色。
　　 4、肺泡灌洗液(BALF)蛋白含量測定顯示LPS組(1.15±0.12)與大腸桿菌組(0.91±0.29)均高于正常組；肺濕干比顯示兩模型組LPS組(5.35±0.45)與大腸桿菌組(4.61±0.19)均明顯高于正常組。
　　 結(jié)論：
　　 1、本實(shí)驗(yàn)成功的復(fù)制了大腸桿菌及LPS誘導(dǎo)的肺內(nèi)外源性急性肺損傷模型，此模型穩(wěn)定性及預(yù)見性好，成功率高，易

11、操作，是目前急性肺損傷研究較好的模型。也是本實(shí)驗(yàn)室成熟的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀２±斫Y(jié)果示造模成功。且兩模型組之間病理損傷評分一致，可以做組間對比。
　　 2、免疫組化證明在肺泡上皮細(xì)胞以及肺血管平滑肌細(xì)胞上存在所研究蛋白TMEM16A。
　　 3、肺泡液蛋白滲出增加，肺濕干比重升高，說明肺泡液體清除率在急性肺損傷時是下降的，這一點(diǎn)在內(nèi)源性急性肺損傷時與氯離子通道表達(dá)量的變化是一致的。
　　 4、TMEM16A在大腸桿菌所致急