氯離子通道-3在內(nèi)皮素-1對(duì)牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞影響中的作用.pdf

1、目的:探討體外培養(yǎng)牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞的最佳方法，并研究?jī)?nèi)皮素-1(ET-1)對(duì)其增殖和移行的影響及氯離子通道-3(chloridechannel3，CLC-3)在其中的作用。 方法:采用2種培養(yǎng)方法和4種培養(yǎng)基體外培養(yǎng)牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞。通過(guò)損傷模型檢測(cè)細(xì)胞移行。采用免疫組化染色法、MTT法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)PCNA表達(dá)、細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期變化。免疫熒光測(cè)定CLC-3蛋白的表達(dá)部位。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、免疫印跡(Wes

2、ternblot)方法檢測(cè)CLC-3mRNA和蛋白的表達(dá)。采用反義核酸技術(shù)，觀察CLC-3基因在ET-1對(duì)體外培養(yǎng)牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞影響中的作用。 結(jié)果:顯微分離后彈力膜及內(nèi)皮細(xì)胞層聯(lián)合延遲消化培養(yǎng)法，體外培養(yǎng)牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞成功率高。采用DMEM/F12(1：1)培養(yǎng)基，細(xì)胞貼壁、生長(zhǎng)、形態(tài)和活性最好。細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均有內(nèi)源性CLC-3基因表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物定位于細(xì)胞膜和部分細(xì)胞漿。ET-1呈劑量相關(guān)性的促進(jìn)培養(yǎng)的牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞增

3、殖和移行，聯(lián)合應(yīng)用重組人表皮生長(zhǎng)因子(rhEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)對(duì)細(xì)胞增殖有協(xié)同作用。ET-1劑量依賴(lài)性增加CLC-3mRNA及蛋白的表達(dá)，氯通道阻斷劑5-硝基-2-(3-苯丙胺)苯甲酸(5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)-benzoicacid，NPPB)和CLC-3反義寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotide，AS-ODN)濃度依賴(lài)性抑制ET-1促進(jìn)細(xì)胞增