細胞內(nèi)鈣在內(nèi)皮素-1促肺腺癌細胞SPC-A1生長中的作用及機制.pdf

1、非小細胞肺癌(Non-smallcelllungcancer，NSCLC)是目前死亡原因居首位的惡性腫瘤之一，起病隱匿，發(fā)現(xiàn)時40％為晚期患者，預(yù)后差。晚期NSCLC的一線標準治療是以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療。Meta分析顯示與最佳支持治療相比，以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療中位生存期延長2個月，1年生存率提高10％。盡管鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療在晚期NSCLC治療中取得一些進展，但其療效似已達平臺，一線治療的有效率很少超過40％，1年生存率多在30％

2、～40％，且以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療毒副作用大。因此，尋找一種高效低毒的治療方法勢在必行。隨著對腫瘤生物學(xué)認識的加深，針對細胞受體、基因、調(diào)控分子等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)為靶點的分子靶向治療(MolecularTargetedthreapy)是近年腫瘤學(xué)研究的熱點。NSCLC目前主要的分子靶點藥物主要針對表皮生長因子受體(EGFR)及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，上述靶向藥物單藥治療晚期NSCLC取得一定的療效，但有效率低。不同靶向藥物的聯(lián)合使用及尋找

3、新的靶向藥物是目前腫瘤治療的新趨勢。內(nèi)皮素-1(Endothelin-1，ET-1)是強大的血管收縮劑，ET-1通過內(nèi)皮素受體(Endothelinreceptors，ETRs)起作用，內(nèi)皮素受體有A(ETAR)和B(ETBR)兩種亞型，它們都屬于G蛋白偶聯(lián)受體，ET-1通過ETRs產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。既往的研究表明，內(nèi)皮素系統(tǒng)與腫瘤關(guān)系密切。內(nèi)皮素系統(tǒng)通過促進腫瘤細胞生長、誘導(dǎo)腫瘤血管形成、抑制腫瘤細胞凋亡及促腫瘤骨轉(zhuǎn)移等方面在腫瘤發(fā)生發(fā)

4、展過程中起重要作用。有研究證實，肺癌組織及細胞存在ET-1及ETRs，肺癌細胞株可自行合成、釋放ET-1及表達ETRs，肺癌患者血漿及支氣管灌洗液中ET-1水平高于正常人，說明內(nèi)皮素系統(tǒng)與肺癌也關(guān)系密切。因此，內(nèi)皮素系統(tǒng)有望成為肺癌靶向治療的新靶點，研究內(nèi)皮素系統(tǒng)與肺癌細胞生長及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制具有重要意義。 ET-1是強大的細胞促有絲分裂素，既往研究顯示，ET-1在體外能夠促進血管內(nèi)皮素細胞、成纖維細胞等正常細胞增殖，同時ET-

5、1也能夠促進卵巢癌、膠質(zhì)瘤等腫瘤細胞生長，且其促細胞生長作用與細胞內(nèi)游離鈣離子(IntracellarfreeCa2+，[Ca2+]i)有關(guān)。ET-1激活ETRs后使電壓依賴性和受體操縱性鈣通道開放，促使細胞外Ca2+內(nèi)流，Ca2+內(nèi)流觸發(fā)細胞內(nèi)Ca2+釋放；激活的ETRs還可通過磷脂酶活化三磷酸肌醇(IP3)促使Ca2+從貯存庫釋放至肌漿，使[Ca2+]i增多。Ca2+是細胞內(nèi)重要的第二信使，也作為細胞核內(nèi)的信號參與DNA復(fù)制、修復(fù)、

6、基因轉(zhuǎn)錄、核蛋白磷酸化等過程，參與許多重要生命活動的調(diào)節(jié)。[Ca2+]i在ETRs促血管平滑肌細胞增值及部分腫瘤細胞如頭頸癌和卵巢癌細胞生長中起重要作用。而在肺癌細胞上ET-1與肺癌細胞生長關(guān)系及其機制目前尚未闡明，本實驗擬通過體外培養(yǎng)肺腺癌SPC-A1細胞株，探討：1、ET-1在SPC-A1細胞生長中的作用；2、鈣信號在ET-1促SPC-A1細胞增殖過程中的作用及其機制。 第一部分內(nèi)皮素-1及其受體在肺腺癌細胞SPC-A1生長

7、中的作用 采用MTT’(四甲基偶氮唑鹽)比色法檢測腫瘤細胞生長，探討ET-1在肺腺癌細胞生長中的作用。實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差(X±s)表示，相關(guān)數(shù)據(jù)采用SPSS11.5軟件進行分析，兩組之間比較采用t檢驗；多組之間比較采用one-wayANOVA方差分析，而后不同組間比較采用LSD檢驗，實驗組與對照組比較用Dunnett's檢驗。P<0.05判定為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果顯示： 1.ET-1(10-15mol/L～10-8

8、mol/L)具促進SPC-A1細胞增殖作用，在10-15mol/L～10-10mol/L濃度范圍，作用呈濃度依賴性，差異有顯著性(F=502.493，P=0.000<0.05)。在10-10mol/L～10-8mol/L時作用呈飽和狀態(tài)。 2.ET-1(10-10mol/L)促SPC-A1細胞增殖作用可被ETAR拮抗劑BQ123(10-7mol/L)阻斷(P=0.001<0.05)，不受ETBR拮抗劑BQ788(10-7mol/

9、L)影響(P=0.872>0.05)。說明ET-1促SPC-A1細胞生長作用是通過作用于細胞膜ETAR。 第二部分內(nèi)皮素-1對人肺腺癌SPC-A1細胞內(nèi)游離鈣離子的影響及機制 采用Fura-2/AM熒光技術(shù)測細胞內(nèi)游離鈣離子濃度([Ca2+]i)，檢測ET-1促肺腺癌SPC-A1細胞[Ca2+]i濃度升高的作用及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差(x±s)表示，相關(guān)數(shù)據(jù)采用SPSS11.5軟件進行分析，兩組之間比較采

10、用t檢驗；多組之間比較采用one-wayANOVA方差分析，而后不同組間比較采用LSD檢驗，實驗組與對照組比較用Dunnett，s檢驗。P<0.05判定為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果顯示： 1.ET-1在體外能夠促進肺腺癌細胞SPC-A1細胞[Ca2+]i濃度升高，ET-1(10-15mol/L～10-8mol/L)呈濃度依賴性，差異有顯著性(F=7284.365，P=0.000<0.05)。其作用能夠被ETAR特異性拮抗劑BQ123

11、完全阻滯(P=0.001<0.05)，ET-1通過ETAR促SPC-A1細胞[Ca2+]i升高。ET-1促SPC-A1細胞[Ca2+]i濃度升高由起始的快速上升期和接下來的平臺期兩個時相組成，由基礎(chǔ)值的57.54±11.9nmol/L，上升到最高89.5+19.5nmol/L。 2.細胞外無Ca2+溶液，[Ca2+]i基礎(chǔ)值顯著降低，同時ET-1促[Ca2+]i的升高的作用可顯著減弱(F=16.653，P=0.002<0.05)

12、。細胞外正常Ca2+溶度時，ET-1作用前加入電壓依賴型鈣通道阻滯劑Nifedipine(10-6mol/L)或非特異性離子通道拮抗劑SKF96365(10-7mol/L)后，ET-1促[Ca2+]i升高作用都明顯減弱，有顯著性差異(P=0.001<0.05)。SKF96365與Nifedipine減弱ET-1促[Ca2+]i升高作用的影響無顯著差別(P=0.720>0.05)。 3、Ryanodine受體激動劑Ryanodin

13、e(50×10-6mol/L)后，ET-1促[Ca2+]i的作用減弱(t=11.353，P=0.004<0.05)。加入磷脂酶C(PLC)抑制劑U73122(10-5mol/L)后，ET-1促[Ca2+]i的作用減弱(P=0.015<0.05)，而U73122無活性類似物U73433(10-5mol/L)不影響ET-1促[Ca2+]i的作用(P=0.921>0.05)。蛋白激酶C(PKC)抑制劑Staurosporine(2×10-9m

14、ol/L)對ET-1促[Ca2+]i的作用無顯著變化(t=0.712，P=0.486>0.05)。 第三部分細胞內(nèi)鈣在內(nèi)皮素-1促肺腺癌細胞SPC-A1生長中的作用 本實驗部分在上述一、二的基礎(chǔ)上采用MTT法測細胞生長，當(dāng)細胞外無Ca2+時及使用特異性L-型Ca2+通道阻滯劑及PLC特異性拮抗劑等，觀察ET-1促肺腺癌細胞生長的作用是否受影響，探討細胞內(nèi)鈣在ET-1促肺腺癌細胞生長中的作用。 實驗結(jié)果以均數(shù)±標準

15、差(x±s)表示，相關(guān)數(shù)據(jù)采用SPSS11.5軟件進行分析，兩組之間比較采用t檢驗；多組之間比較采用one-wayANOVA方差分析，而后不同組間比較采用LSD檢驗，實驗組與對照組比較用Dunnett’s檢驗。P<0.05判定為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果顯示： 1、細胞外無Ca2+并用EGTA進一步清除細胞外二價離子形成細胞外無Ca2+溶液，ET-1促SPC-A1細胞生長的作用顯著受抑制(P=0.001<0.05)。L-型Ca2+通

16、道阻滯劑Nifedipine(10-6mol/L)能夠阻斷ET-1促SPC-A1細胞生長作用(P=0.001<0.05)。 2、磷脂酶C特異性(PLC)拮抗劑U73122也能夠部分抑制ET-1促SPC-A1細胞生長的作用(P=0.001<0.05)；U73122類似物U73433對ET-1的上述作用無影響(P=0.986>0.05)。 結(jié)論：在體外，ET-1通過激活人肺腺癌SPC.A1細胞ETAR受體促進細胞生長及[Ca