Ad-ING4-polyA-promoter-OSM對(duì)SPC-A1肺腺癌細(xì)胞的體外抑癌增效作用及其分子機(jī)制.pdf

1、目的：研究ING4(腫瘤生長(zhǎng)抑制因子4)和OSM（抑瘤素M）雙基因共表達(dá)腺病毒載體對(duì)SPC-A1肺腺癌細(xì)胞的體外抑癌增效作用及其分子機(jī)制。
　　方法：構(gòu)建ING4和OSM雙基因共表達(dá)的重組復(fù)制缺陷型腺病毒載體Ad-ING4-polyA-promoter-OSM(簡(jiǎn)稱Ad-ING4-OSM)。感染QBI-293A細(xì)胞，進(jìn)行病毒擴(kuò)增和效價(jià)測(cè)定。用RT-PCR法鑒定目的基因的轉(zhuǎn)錄。用50MOI的Ad-ING4-OSM作用于體外培養(yǎng)的人肺

2、腺癌細(xì)胞SPC-A1，RT-PCR法、Westernblotting法鑒定目的基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。MTT法檢測(cè)PBS組、AdV組、Ad-ING4組、Ad-OSM組、Ad-ING4-OSM組對(duì)SPC-A1細(xì)胞作用1～4天的生長(zhǎng)抑制作用，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，并通過流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)上述各組對(duì)SPC-A1細(xì)胞凋亡率的影響。通過對(duì)比分析研究Ad-ING4-OSM的抑癌增效作用。用RT-PCR檢測(cè)P27，P53及Survivin等凋亡相關(guān)基因的

3、轉(zhuǎn)錄，并用Westernblotting檢測(cè)CleavedCaspase-3的表達(dá)，探討Ad-ING4-OSM誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建了雙啟動(dòng)子（polyA+promoter）介導(dǎo)的ING4和OSM雙基因共表達(dá)腺病毒載體（Ad-ING4-polyA+promoter-OSM）。Ad-ING4-OSM可在QBI-293A細(xì)胞中復(fù)制增殖，48h后在倒置顯微鏡下可見細(xì)胞變圓，呈葡萄狀聚集，倒置熒光顯微鏡下可見綠色

4、熒光，呈現(xiàn)高感染效率。RT-PCR檢測(cè)可見ING4和OSM基因成功轉(zhuǎn)錄。病毒效價(jià)檢測(cè)可高達(dá)109pfu/ml。Ad-ING4-OSM作用于SPC-A1細(xì)胞后，RT-PCR、Westernblotting結(jié)果顯示目的基因在SPC-A1細(xì)胞中成功轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，并能顯著抑制SPC-A1細(xì)胞的生長(zhǎng)且呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。RT-PCR結(jié)果顯示該雙基因可明顯上調(diào)SPC-A1肺腺癌細(xì)胞中的P27，P53基因轉(zhuǎn)錄和下調(diào)Survivin基因的轉(zhuǎn)錄。Ad-ING4

5、-OSM對(duì)SPC-A1細(xì)胞生長(zhǎng)抑制及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用明顯優(yōu)于Ad-ING4、Ad-OSM單基因組（P＜0.05)，顯示雙基因具有抑癌增效的協(xié)同作用（Q=1.18）。
　　結(jié)論：
　　1、成功構(gòu)建了ING4和OSM雙基因共表達(dá)腺病毒載體Ad-ING4-OSM。
　　2、Ad-ING4-OSM雙基因共表達(dá)能在體外抑制肺癌SPC-A1細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡，且呈現(xiàn)明顯的抑癌增效協(xié)同作用。
　　3、Ad-ING4-OSM