Ad-LIF-IL-24共表達(dá)腺病毒載體對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑癌增效和分子機(jī)制的研究.pdf

1、目的：構(gòu)建LIF和IL-24雙基因共表達(dá)腺病毒載體(Ad-LIF-IL-24)，研究其對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑癌增效和分子機(jī)制。 方法：分別以pORF-mbcl-2α質(zhì)粒為模板，PCR分別擴(kuò)增出polyA和promoter基因片段，再以此為模板，經(jīng)SOE-PCR擴(kuò)增polyA+promoter(SalI、NotI)融合片段，并突變其中的Pac I酶切位點(diǎn)。再以pcDNA3.0-LIF質(zhì)粒和pAdTrack-CMV-IL-24質(zhì)粒為模板，

2、PCR擴(kuò)增出LIF(BglII、SalI)和IL-24(XhoI、XbaI)目的片段，并與突變后polyA+promoter(簡(jiǎn)稱polyA+promoter△)依次亞克隆至pAdTrack-CMV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒構(gòu)建pAdTrack-CMV-LIF-polyA+promoter△-IL-24雙基因共表達(dá)重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。將構(gòu)建正確的pAdTrack-CMV-LIF-polyA+promoter△-IL-24重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒經(jīng)PmeI酶切后與pAdEa

3、sy-1腺病毒骨架質(zhì)粒在BJ5183大腸桿菌中同源重組，得到的同源重組質(zhì)粒pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-LIF-polyA+promoter△-IL-24(簡(jiǎn)稱為pAd-LIF-polyA+promoter△-IL-24)經(jīng)PacI酶切后再用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染QBI-293A細(xì)胞，經(jīng)多輪感染和擴(kuò)增后獲得Ad-LIF-polyA+promoter△-IL-24(簡(jiǎn)稱Ad-LIF-IL-24)雙基因共表達(dá)重組腺病毒載體。將Ad-LI

4、F-IL-24體外感染腫瘤細(xì)胞SMMC-7721、U251、HT29、A549、HL-60、K562和正常細(xì)胞WI-38，篩選出Ad-LIF-IL-24最敏感腫瘤細(xì)胞和最佳感染劑量。MTT法和FCM檢測(cè)Ad-LIF-IL-24對(duì)敏感腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制和誘導(dǎo)凋亡的增效作用，Hochest染色進(jìn)一步檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡的核形態(tài)特征，用RT-PCR檢測(cè)與細(xì)胞凋亡和腫瘤血管形成相關(guān)基因bcl-2、bax、ICE、p53和HIF-1α的轉(zhuǎn)錄，West

5、ern blotting檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡執(zhí)行蛋白CleavedCaspase3的表達(dá)。 結(jié)果：成功構(gòu)建了雙啟動(dòng)子介導(dǎo)的LIF和IL-24雙基因共表達(dá)腺病毒載體Ad-LIF-IL-24。Ad-LIF-IL-24均能高效感染實(shí)體瘤細(xì)胞和正常人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞WI-38，但對(duì)白血病細(xì)胞感染效率很低，并且對(duì)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞抑制作用最為明顯，最佳感染劑量為100MOI。腺病毒介導(dǎo)的LIF和IL-24雙基因共表達(dá)在體外能明顯抑

6、制U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡，并呈現(xiàn)疊加效應(yīng)。分子機(jī)制檢測(cè)結(jié)果表明：Ad-LIF-IL-24能明顯上調(diào)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞ICE、bax、p53和下調(diào)bcl-2、HIF-1α等基因的轉(zhuǎn)錄，并激活Caspase3剪切成Cleaved Caspase3片段。 結(jié)論：成功構(gòu)建的LIF和IL-24雙基因共表達(dá)腺病毒載體Ad-LIF-IL-24體外能明顯抑制U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)其凋亡，并呈現(xiàn)疊加作用。Ad-LIF-IL-24可