ADAM23基因?qū)Ψ蜗侔┘?xì)胞SPC-A-1浸潤和轉(zhuǎn)移的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、背景:肺癌是最常見的惡性腫瘤之一。浸潤和轉(zhuǎn)移是肺癌病人死亡的主要因素。因此深入探討肺癌浸潤和轉(zhuǎn)移的機(jī)制，尋找肺癌浸潤和轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子，對肺癌的臨床治療和預(yù)后具有重要的意義。
　　去整合素-金屬蛋白酶23(ADAM23，A Disintegrin AndMetalloprotease23)基因?qū)儆贏DAM家族，是鋅蛋白酶總屬的一種跨膜糖蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞及細(xì)胞-基質(zhì)間的黏附融合。近來研究發(fā)現(xiàn)ADAM23作為一種抑癌基因，其表達(dá)缺失

2、與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌中，ADAM23由于啟動子區(qū)甲基化而呈低表達(dá)，且與肺癌的浸潤轉(zhuǎn)移負(fù)相關(guān);ADAM23可通過負(fù)調(diào)控αvβ3而介導(dǎo)肺癌的浸潤轉(zhuǎn)移。ADAM23在肺癌浸潤轉(zhuǎn)移中具有重要作用，但其具體機(jī)制尚不明確。
　　上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition， EMT)是指上皮性細(xì)胞在特定的生理和病理情況下向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的現(xiàn)象。研究表明EM

3、T在惡性腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，與腫瘤臨床分期密切相關(guān)。但在肺癌浸潤轉(zhuǎn)移過程中ADAM23與EMT關(guān)系尚未見文獻(xiàn)報道。
　　人類fascin1基因?qū)儆趂ascin家族，其蛋白質(zhì)編碼產(chǎn)物是分子量為55KD，能與F-肌動蛋白結(jié)合的細(xì)胞骨架蛋白，定位于細(xì)胞質(zhì)張力纖維中，與細(xì)胞膜皺褶邊緣的絲狀偽足及微棘的形成有關(guān)，這些結(jié)構(gòu)與腫瘤細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。研究表明fascin1參與了肝癌EMT的形成;在多數(shù)腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，并且

4、與腫瘤的區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及病人的預(yù)后密切相關(guān)。近來有研究報道fascin1在肺癌浸潤轉(zhuǎn)移中起重要作用。
　　microRNA（miRNA）是一類長約19～25個核苷酸的非蛋白編碼的單鏈RNA分子，能在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá)或翻譯，與個體發(fā)育、增殖、分化以及惡性腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。研究表明miRNA可作為癌基因或抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，在腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。
　　本實驗旨在研究ADAM2

5、3基因?qū)Ψ蜗侔┘?xì)胞SPC-A-1浸潤和轉(zhuǎn)移特性的影響，檢測穩(wěn)定抑制ADAM23表達(dá)的肺腺癌細(xì)胞中miRNA差異表達(dá)譜的變化，探討ADAM23在肺癌浸潤轉(zhuǎn)移過程中的作用和機(jī)制，及其與EMT和促腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移分子fascin1的相互關(guān)系，以及ADAM23可直接調(diào)控的miRNA，為深入探討肺癌浸潤轉(zhuǎn)移的機(jī)制，并為以ADAM23作為靶點的肺癌基因治療提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。
　　方法:
　　(1)利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，分別瞬時轉(zhuǎn)

6、染干擾質(zhì)粒ADAM23-shRNA-1、ADAM23-shRNA-2、ADAM23-shRNA-3和空白質(zhì)粒(pYr-3.1-CON)到SPC-A-1細(xì)胞，以空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組為陰性對照，以空白轉(zhuǎn)染組（本底細(xì)胞）為空白對照;分別采用real time PCR和western blot檢測3個干擾質(zhì)粒，篩選出抑制效率最佳的干擾質(zhì)粒;
　　(2)利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒ADAM23-shRNA-3、pYr-3.1-CON到S

7、PC-A-1細(xì)胞，經(jīng)G418篩選得到穩(wěn)定抑制ADAM23表達(dá)的肺腺癌陽性克隆細(xì)胞（shADAM23）;分別采用real time PCR和western blot檢測shADAM23細(xì)胞、pYr-3.1-CON細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染組(NT)三組細(xì)胞中ADAM23 mRNA及蛋白的表達(dá);
　　(3)采用westernblot檢測shADAM23細(xì)胞中TWIST、E-cadherin、vimentin、α-SMA的蛋白表達(dá);
　　(4)

8、采用real time PCR和westem blot檢測shADAM23細(xì)胞中fascin1 mRNA和蛋白表達(dá)水平，并分析ADAM23與fascin1的相關(guān)性;
　　(5)用Transwell侵襲實驗、Transwell遷移實驗檢測shADAM23細(xì)胞侵襲遷移能力的變化;
　　(6)用miRNA芯片檢測shADAM23中miRNA表達(dá)譜的變化。
　　結(jié)果:
　　(1) ADAM23-shRNA-3可有效抑制S

9、PC-A-1中ADAM23mRNA和蛋白的表達(dá);
　　(2)經(jīng)G418篩選，real time PCR及western blot鑒定，成功建立了穩(wěn)定抑制ADAM23表達(dá)的肺腺癌陽性克隆細(xì)胞（shADAM23）;
　　(3)與CON和NT比較，shADAM23細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)降低，TWIST、vimentin、α-SMA表達(dá)升高;
　　(4)與CON和NT比較，shADAM23細(xì)胞中fascin1 mRNA

10、和蛋白表達(dá)升高;
　　(5)與CON和NT比較，shADAM23細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)(P＜0.05);
　　(6)與CON比較，芯片結(jié)果顯示shADAM23細(xì)胞中34個miRNA表達(dá)上調(diào)，36個miRNA表達(dá)下調(diào)。
　　結(jié)論:
　　(1) ADAM23基因低表達(dá)能增強(qiáng)肺腺癌細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移能力;
　　(2) ADAM23基因低表達(dá)可通過上調(diào)TWIST,誘導(dǎo)EMT的發(fā)生促進(jìn)肺腺癌的浸潤轉(zhuǎn)移;
　　(