細(xì)絲蛋白A調(diào)控EGFR活化對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響.pdf

1、肺癌是目前世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，每年都有超過(guò)一百萬(wàn)新發(fā)病例，其中約80％為非小細(xì)胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)。作為一種全身性疾病，肺癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)是由多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)，多因素參與的復(fù)雜過(guò)程。對(duì)腫瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究有助于闡明NSCLC的發(fā)病機(jī)制，為NSCLC的治療提供新的分子靶點(diǎn)。
　　 表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermalgrowthfactorrecep

2、tor，EGFR)為具有酪氨酸激酶活性的受體，分子量170kDa(1186氨基酸)，位于染色體7q12。EGFR家族有4個(gè)結(jié)構(gòu)相似的受體分子:ErbB1(EGFR)、ErbB2（HER2）、ErbB3(HER3)、ErbB4（HER4）。EGFR為跨膜受體，有細(xì)胞外的配體結(jié)合區(qū)域，跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸激酶活性區(qū)域組成。EGFR具有酪氨酸激酶活性，通過(guò)與配體結(jié)合，EGFR形成同源或異源二聚體而活化，進(jìn)一步激活受體介導(dǎo)的多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，

3、如Ras/Raf/MEK/ERK、PI3K/Akt通路等，發(fā)揮促進(jìn)腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及腫瘤血管生成作用。EGFR由表皮生長(zhǎng)因子（epidermalgrowthfactor，EGF）激活，調(diào)節(jié)正常和惡性上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和存活。EGFR在40-80％的NSCLC過(guò)表達(dá)中表達(dá)，而且其表達(dá)與預(yù)后不佳相關(guān)。因此，EGFR和它的家族成員已成為靶向治療的主要候選靶分子。NSCLC患者EGFR過(guò)表達(dá)，往往提示TNM分期晚，出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性大

4、，進(jìn)展快，預(yù)后不良。
　　 細(xì)絲蛋白A(filaminA，F(xiàn)LNa)是非肌性肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，基因結(jié)構(gòu)高度保守，表達(dá)廣泛，對(duì)哺乳動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的作用。FLNa蛋白包括一個(gè)肌動(dòng)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域和24個(gè)串聯(lián)的重復(fù)序列，研究發(fā)現(xiàn)FLNa重復(fù)序列所形成的類似免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)的多重β-折疊片層結(jié)構(gòu)，為蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用提供了界面。FLNa涉及多條與腫瘤形成有關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如MAPK/ERK、PI3K/Akt、TGF-β等，影

5、響腫瘤細(xì)胞的增殖、粘附、遷移和侵襲等行為。許多研究表明，F(xiàn)LNa在人類上皮腫瘤例如肝癌、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤表達(dá)增多。Zhu認(rèn)為FLNa對(duì)于人黑色素瘤細(xì)胞EGFR的活化具有調(diào)控作用。FLNa是否調(diào)控肺腺癌細(xì)胞EGFR的活化目前尚無(wú)報(bào)道。
　　 本研究擬通過(guò):(1)Westernblot檢測(cè)不同肺腺癌細(xì)胞中FLNa、EGFR蛋白的表達(dá)情況;(2)采用MTT法檢測(cè)5種不同肺腺癌細(xì)胞的增殖能力;(3)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)

6、沉默F(xiàn)LNa的表達(dá)，構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，采用MTT法、劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)（Woundhealingassay）及Transwell法(Transwellcellinvasionassay)檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力;(4)利用westernblot、免疫共沉淀法(Immunoprecipitation，IP)檢測(cè)EGFR磷酸化水平及其下游信號(hào)通路分子的變化。旨在從細(xì)胞、分子水平上分析FLNa對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，探討F

7、LNa調(diào)控EGFR磷酸化及其下游信號(hào)分子的作用機(jī)制，為更有效治療肺腺癌提供新靶點(diǎn)。
　　 目的:觀察不同肺腺癌細(xì)胞FLNa和EGFR的表達(dá)情況，分析FLNa、EGFR與肺腺癌細(xì)胞增殖的關(guān)系;將pSIF1-FLNasiRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染GLC-82細(xì)胞，降低FLNa的表達(dá)水平，觀察FLNa對(duì)GLC-82細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響;探討FLNa調(diào)控EGFR磷酸化及其下游信號(hào)分子的作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 1、W

8、esternblot檢測(cè)不同肺腺癌細(xì)胞中FLNa、EGFR蛋白的表達(dá)情況;
　　 2、采用MTT法檢測(cè)不同肺腺癌細(xì)胞的增殖能力;
　　 3、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默F(xiàn)LNa的表達(dá)，構(gòu)建穩(wěn)定低表達(dá)FLNa細(xì)胞，采用MTT法、Woundhealingassay及Transwell法，檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力;
　　 4、Westernblot、IP檢測(cè)EGFR酪氨酸磷酸化水平及其下游信號(hào)通路分子的變化。

9、　　 結(jié)果:
　　 1、不同肺腺癌細(xì)胞的蛋白表達(dá)情況和增殖能力
　　 1.1、不同肺腺癌細(xì)胞的蛋白表達(dá)情況
　　 應(yīng)用ImageJ軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行掃描，SPSS13.0進(jìn)行分析，不同肺腺癌細(xì)胞FLNa、EGFR的表達(dá)水平分別為:GLC-82(1.02±0.18，0.86±0.01)，H1975(1.15±0.05,0.92±0.01),A549(0.64±0.03,0.95±0.01),H1650(0.22±

10、0.01,0.69±0.01)和H1299(0.79±0.02,1.13±0.01)。H1650細(xì)胞FLNa和EGFR的表達(dá)水平均低于其余各種細(xì)胞，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 1.2、不同肺腺癌細(xì)胞的增殖情況
　　 利用MTT比色分析法測(cè)定各孔的OD值，分別于EGF刺激20h、44h后檢測(cè)各孔的OD值，EGF刺激20h、44h后各種細(xì)胞OD值分別為:GLC-82(0.42±0.01,0.64±0.09),H

11、1975(0.40±0.03,0.54±0.06),A549(0.30±0.02,0.65±0.06)，H1650(0.12±0.01，0.20±0.03)和口H1299(0.40±0.02，0.91±0.00)，低表達(dá)FLNa的H1650細(xì)胞的OD值各時(shí)間點(diǎn)均明顯低于其余各種細(xì)胞，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 2、實(shí)時(shí)定量PCR、westernblot驗(yàn)證沉默F(xiàn)LNa效果
　　 2.1、實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)穩(wěn)定

12、轉(zhuǎn)染細(xì)胞的FLNamRNA水平
　　 利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)GLC-82穩(wěn)定細(xì)胞FLNamRNA的水平，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FLNasiRNA的GLC-82細(xì)胞FLNamRNA的相對(duì)定量值（0.38±0.23）明顯低于對(duì)照組細(xì)胞(1.00)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 2.2、Westernblot檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞FLNa的表達(dá)水平
　　 Westernblot檢測(cè)GLC-82穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞FLNa的蛋白水平，穩(wěn)定轉(zhuǎn)

13、染FLNasiRNA的GLC-82細(xì)胞FLNa的相對(duì)表達(dá)量（0.39±0.00），明顯低于對(duì)照細(xì)胞（0.66±0.00），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3、GLC-82穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲情況
　　 3.1、GLC-82穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖情況
　　 將GLC-82穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種于96孔板，MTT法檢測(cè)各孔的OD值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分別經(jīng)0nM、4nM、20nMEGF刺激后各孔的OD值，GLC-82

14、/FLNasiRNA組(0.48±0.02，0.64±0.03，0.70±0.04)各濃度均明顯低于對(duì)照組(0.55±0.04，0.73±0.05，0.81±0.04)，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.2、GLC-82穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的遷移情況
　　 利用相應(yīng)軟件測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率:細(xì)胞遷移率=（劃痕初始寬度．劃痕目前寬度）/2/劃痕初始寬度×100％。無(wú)EGF刺激時(shí)，降低FLNa表達(dá)的GLC-82細(xì)胞

15、分別于8h、16h、24h和32h的遷移率（8.11±2.45％，15.78±0.84％，16.23±2.27％，19.89±2.91％）各時(shí)間點(diǎn)均低于對(duì)照組(15.47±0.74％，21.38±1.66％，25.00±2.17％，30.43±0.11％)，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);GLC-82/FLNasiRNA細(xì)胞給予20nMEGF刺激后，各時(shí)間點(diǎn)的遷移率明顯高于無(wú)EGF刺激組;GLC-82/Control細(xì)胞給予20nME

16、GF刺激后，從24h開(kāi)始細(xì)胞遷移率明顯高于無(wú)EGF刺激組，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.3、GLC-82穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的侵襲情況
　　 采用Transwell法檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力，GLC-82/FLNasiRNA組穿膜細(xì)胞數(shù)(192±70)明顯低于對(duì)照組(368±73)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4、FLNa作用機(jī)制的探討
　　 4.1、沉默F(xiàn)LNa表達(dá)對(duì)GLC-82細(xì)胞EGFR活

17、化的影響
　　 培養(yǎng)GLC-82穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，Westernblot檢測(cè)EGF刺激0min、5min、10min、30min后蛋白的表達(dá)情況。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，F(xiàn)LNasiRNA組各時(shí)間點(diǎn)FLNa的表達(dá)量（0.10±0.00，0.28±0.00，0.25±0.00，0.18±0.00）均明顯低于對(duì)照組（0.52±0.00，0.72±0.00，0.71±0.00，0.73±0.04），均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);FLNasiRNA

18、組磷酸化EGFR分別于EGF刺激5min、10min、30min后的表達(dá)水平（0.74±0.00，0.53±0.00，0.23±0.00）均明顯低于對(duì)照組（0.81±0.00，0.68±0.00，0.60±0.02），均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）;FLNasiRNA組磷酸化ERK分別于EGF刺激5min、10min、30min后的表達(dá)水平（0.32±0.00，0.40±0.00，0.31±0.00）均明顯低于對(duì)照組（0.38±0.01

19、，0.63±0.00，0.98±0.01），均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 4.2、IP證實(shí)FLNa對(duì)EGFR活化的影響
　　 經(jīng)抗EGFR抗體免疫沉淀后，用抗酪氨酸磷酸化的抗體4G10進(jìn)行印跡，觀察EGFR磷酸化水平:EGF刺激5min后，F(xiàn)LNasiRNA組EGFR相對(duì)磷酸化水平（0.95±0.03）明顯低于對(duì)照組（1.16±0.01），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　 結(jié)論:
　　 1、