MicroRNA-155在肺腺癌中的表達(dá)及對肺腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、肺腺癌(lung adenocarcinoma)是肺癌中一種比較常見的病理類型，屬于非小細(xì)胞癌，大約占肺癌發(fā)病總數(shù)的40％左右。肺癌有許多呼吸道以及心血管系統(tǒng)并發(fā)癥，治療仍以手術(shù)為主，對于無法手術(shù)的中、晚期患者則以放療和化療為主。如果得不到及時的控制，急速惡化下去，對患者的生命產(chǎn)生極大的威脅，并造成沉重的個人和社會負(fù)擔(dān)。
　　肺部腺癌一般起源于細(xì)小支氣管粘膜上皮，少數(shù)起源于大支氣管的粘液腺。疾病發(fā)生的確切機制目前尚不明確。近年來致

2、力于機制研究的國內(nèi)外學(xué)者從組織酶學(xué)、癌基因突變研究、細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長因子調(diào)控及其受體通路等方面對肺癌發(fā)生的機制從分子水平進行了詳細(xì)深入的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織中某些生長因子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子基因表達(dá)上調(diào);同時與細(xì)胞分化、增殖、凋亡有密切相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)也發(fā)生了相應(yīng)的改變。近年來興起的靶向治療已經(jīng)取得了良好的效果，從某種意義上做到了“個體化治療”，療效確切。而這項新治療方法的應(yīng)用得益于對肺癌發(fā)病機制的深入研究，使得可以在分子病理的基礎(chǔ)

3、上做到對腫瘤細(xì)胞的精確打擊。
　　新近的研究證實了細(xì)胞的基本生物過程，包括增殖、分化和死亡，均受到一類小分子RNA的調(diào)控，這類小分子RNA被稱為MicroRNA(miRNA)，它們的長度通常在20-30nt左右。MicroRNA對細(xì)胞的調(diào)控作用是通過對目的信使RNA(mRNA)的3'-N端的非翻譯區(qū)的相應(yīng)位點結(jié)合以后，沉默靶基因表達(dá)，影響蛋白質(zhì)翻譯，進而調(diào)控細(xì)胞的各種生物學(xué)功能，從而實現(xiàn)對疾病進程和預(yù)后的影響。MicroRNA并不

4、是常規(guī)的遺傳物質(zhì)，而是一種重要的調(diào)節(jié)因子，在蛋白質(zhì)翻譯過程中，起到重要的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)60％左右MicroRNA結(jié)合位點的定位都與腫瘤及異常增生性疾病相關(guān)。據(jù)計算分析，在所有執(zhí)行蛋白編碼的基因中，MicroRNA的數(shù)量大約有3％，同時有高達(dá)40％的蛋白編碼基因可以做為靶基因而可能受到miRNA的調(diào)控。
　　已知的miRNA相關(guān)研究中，除了少數(shù)幾個公認(rèn)在各類腫瘤中都有異常表達(dá)的微小RNA家族外，其他研究的結(jié)果并非完全一致，造成這

5、種局面的原因與microRNA的數(shù)目繁多，調(diào)控機制復(fù)雜，所影響的靶基因及其相應(yīng)的信號通路交聯(lián)繁浩有著直接的關(guān)系。另外，在不同種類的疾病，不同疾病進程，不同地區(qū)及國家人種間，很多潛在的因素均可影響到microRNAs的表達(dá)水平。本研究從所在地就診患者人群為研究樣本，開展了肺腺癌與microRNA關(guān)系的研究，擬探討在本地區(qū)患病人群中，microRNA與疾病發(fā)生發(fā)展的聯(lián)系。
　　本課題前期的研究結(jié)果顯示，除外miR-21以外，在腫瘤組織

6、中miR-182,miR-155，miR-197，miR-210均有著較正常對照異常升高的表達(dá)水平，其中又以miR-155的差異表達(dá)倍數(shù)為最高（除外miR-21）。考慮到miR-21在研究比較成熟，在各類型腫瘤性疾病中都有顯著升高的表達(dá)，本課題依據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果，選擇miR-155為研究對象，觀察其在體內(nèi)外肺腺癌中的表達(dá)水平，并試圖探討其在肺腺中異常表達(dá)的機制。
　　人類MicroRNA-155(Hsa-miR-155，miR-1

7、55)是已確認(rèn)的microRNAs家族中重要的成員。新近證實在動物實驗中，miR-155在肺癌組織中的表達(dá)發(fā)生異常，表達(dá)水平明顯高于同體正常肺組織，且亦有臨床調(diào)查研究提示miR-155與肺癌患者的預(yù)后有密切相關(guān)。但目前關(guān)于miR-155的系統(tǒng)研究，尤其在與肺癌發(fā)生發(fā)展及具體機制還比較少，而具體到miR-155對肺腺癌細(xì)胞增殖分化或死亡調(diào)控作用的研究則更未見報道。miR-21是研究最早而且最深入的miRNAs之一，在本研究中它不是研究對象

8、，對miR-21的檢測只是為了作為陽性對照，可以為課題研究對象miR-155的表達(dá)提供參照和參考。
　　我們通過觀察并詳細(xì)分析miR-155在肺腺癌組織及患者血清中的表達(dá)，并使用慢病毒體外轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑來觀察其對人肺癌A549、SPC-A-1、LTEP-a-2細(xì)胞體外生長的影響，探討其可能的作用機制，為進一步深入研究miR-155與肺癌的關(guān)系提供前期理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。
　　研究目的：
　　1.觀察肺癌相關(guān)M

9、icroRNA在肺癌組織和健康組織中的表達(dá)，尤其是MicroRNA-21、MicroRNA-155在肺癌病人和健康對照組織中的差異表達(dá)情況，研究MicroRNA-155在肺腺癌增殖和凋亡中的作用。
　　2.檢測MicroRNA-21、MicroRNA-155在肺癌病人和健康對照人群血清中的差異表達(dá)情況，評價miR-155在肺癌發(fā)生發(fā)展各階段的差異表達(dá)情況，以及做為新近腫瘤標(biāo)記物在預(yù)測肺癌早期檢測中的價值。
　　3.建立肺腺癌

10、細(xì)胞系體外研究模型，研究MicroRNA-155在肺癌細(xì)胞A549、SPC-A-1、LTEP-a-2中的表達(dá)情況。使用介導(dǎo)MicroRNA-155抑制體(miR-155 Inhibitor)的慢病毒載體，分別轉(zhuǎn)染miR-155 Inhibitor至體外培養(yǎng)的A549、SPC-A-1、LTEP-a-2細(xì)胞中，觀察下調(diào)MicroRNA-155在細(xì)胞中的表達(dá)后，對肺腺癌細(xì)胞生長增殖以及侵襲凋亡能力的影響。
　　4.以介導(dǎo)MicroRNA

11、-155抑制體的慢病毒載體，分別轉(zhuǎn)染miR-155 Inhibitor至體外培養(yǎng)的A549、SPC-A-1、LTEP-a-2細(xì)胞中，觀察下調(diào)MicroRNA-155對肺癌細(xì)胞中MicroRNA-155及其靶基因PTEN(phosphatase and tensin homolog)、PI3K(phosphatidylinositol3-kinase)蛋白表達(dá)的影響，為開展基于miRNA的靶基因治療提供依據(jù)。
　　第一部分 miR-

12、21、miR-155在人肺腺癌組織中的表達(dá)
　　方法：
　　1.從36例肺腺癌手術(shù)患者所切除的組織中，選取癌變以及正常組織，分別提取其中的微小RNA(＜～200nt)，通過Nanodrop(@)分析儀測量吸光值來檢測所提取RNA的純度和濃度。
　　2.使用實時熒光定量PCR技術(shù)，檢測癌變以及正常組織中miR-21、miR-155的表達(dá)情況。
　　3.半定量實時熒光RT-PCR技術(shù)檢測各不同肺腺分期的患者腫瘤組織中

13、miR-21、miR-155的表達(dá)情況。
　　結(jié)果
　　1.miR-21、miR-155在肺腺癌患者腫瘤組織中及正常對照組織中均可檢測到，結(jié)果穩(wěn)定可靠。
　　2.miR-21、miR-155在肺腺癌患者組織中的表達(dá)高于正常對照組織中的表達(dá);miR-21在各組組織中的表達(dá)均高于miR-155的表達(dá)(P＜0.05)。
　　3.檢測miR-21、miR-155在各期腫瘤患者組織中的表達(dá)，提示各期中均以STAGEⅠ中的表

14、達(dá)最低。miR-21在STAGEⅡ，STAGEⅢ，STAGEⅣ中表達(dá)均有升高，以STAGEⅢ最高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4.miR-155在各期腫瘤患者組織中的表達(dá)顯示，STAGEⅠ中的表達(dá)水平最低，依次升高為STAGEⅣ，STAGEⅢa中升高，最高為STAGEⅡ以及STAGEⅢb。STAGEⅡ、STAGEⅢ與STAGEⅠ相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　第二部分 miR-21、miR-155在

15、肺腺癌病人血清中的表達(dá)
　　方法：
　　1.隨機選擇36名肺腺癌患者和32名健康對照，入組病人按照肺腺診斷病理標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格入組并排除其他疾病。健康對照組排除肺部及腫瘤性疾病。采用離心法對肺腺癌病人血液和健康對照組血液進行離心收集，取得血清樣本。
　　2.提取各血清樣本中的微小RNA(＜～200nt)，通過Nanodrop(@)分析儀測量吸光值來檢測所提取RNA的純度和濃度。
　　3.實時熒光定量PCR技術(shù)檢測miR-

16、21、miR-155在各樣本中的表達(dá)情況。
　　4.結(jié)合樣本CEA、CA-125檢測值，聯(lián)合miR-155進行ROC曲線分析。
　　結(jié)果
　　1.從人血清中獲取足夠數(shù)量的MicroRNA，用于擴增檢測。
　　2.以miR-155在健康組中的表達(dá)做為參照對象，定義為“單位1”，miR-155在肺腺癌病人血清中的表達(dá)與其相比，是它的2.03士0.34倍，miR-21在肺腺癌病人血清中的表達(dá)是健康對照血清的4.06±1

17、.43倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.miR-155在各期肺腺癌患者血清中均可穩(wěn)定檢測到表達(dá)，其中在Ⅱ期患者血清中的表達(dá)高于其他各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.ROC分析顯示，在肺腺癌的診斷中miR-155比CEA、CA-125有更好的特異性，miR-155與CA-125的聯(lián)合檢測分析可以提高肺腺癌的診斷效能。
　　第三部分下調(diào)MicroRNA-155在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)對細(xì)胞增殖、凋亡

18、和侵襲能力的影響
　　方法
　　1.實驗對象選擇A549，SPC-A-1，LTEP-a-2三個常用肺腺癌細(xì)胞系進行干預(yù)和觀察。各肺腺癌細(xì)胞系實驗分組:Mock組（空白對照組）未干預(yù)肺癌細(xì)胞miR-155 Inhibitor組（實驗組），miR-155 NC組（陰性對照組）。
　　2.利用介導(dǎo)MicroRNA-155 Inhibitor的慢病毒載體感染培養(yǎng)的肺腺癌細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察病毒感染效率，熒光定量PCR技術(shù)檢測M

19、icroRNA-155的表達(dá)，初步確定MicroRNA-155 Inhibitor的干擾效能。
　　3.將未干預(yù)細(xì)胞及感染慢病毒后的肺腺癌細(xì)胞以2×104/ml密度接種于96孔板中，培養(yǎng)120小時，每12小時取出3孔計數(shù)細(xì)胞并記錄，繪制細(xì)胞生長曲線。
　　4.細(xì)胞處理同上一步驟，于96小時中止培養(yǎng)并取各組細(xì)胞運用PI進行染色;之后利用流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry, FCM)檢測細(xì)胞周期的分布。
　　5.細(xì)胞

20、轉(zhuǎn)染接種同時給予EdU添加，培養(yǎng)48小時后使用Apollo(@)及 Hoechst3342標(biāo)記的染色劑結(jié)合后，在熒光顯微鏡下察看細(xì)胞增殖的情況。轉(zhuǎn)染后48小時，使用Transwell侵襲實驗檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞侵襲能力的改變情況。
　　6.細(xì)胞經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染72小時后分別利用AnnexinⅤ-FITC法觀察細(xì)胞早期凋亡;同時TUNEL標(biāo)記原位酶，利用熒光顯微鏡觀察檢測細(xì)胞凋亡情況。
　　7.WesternBlot檢測肺腺癌細(xì)胞經(jīng)Mi

21、croRNA-155 Inhibitor干擾后，各細(xì)胞系中PTEN和PI3K蛋白表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：
　　1.各肺癌細(xì)胞系中Inhibitor組miR-155的表達(dá)顯著低于相應(yīng)NC組和Mock組，miR-155在NC組中的表達(dá)是Inhibitor組的8.15士0.37倍，Mock組中的表達(dá)是Inhibitor組的10.32±0.67倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);而在NC組和Mock組的組間表達(dá)經(jīng)分析無統(tǒng)計學(xué)差異(

22、P＞0.05)。
　　3.經(jīng)MicroRNA-155 Inhibitor轉(zhuǎn)染干擾后的肺腺癌細(xì)胞系的細(xì)胞生長和增殖受到抑制，轉(zhuǎn)染后36小時Inhibitor組的細(xì)胞密度與NC組和Mock組進行比較分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，轉(zhuǎn)染后60小時開始，兩對照組細(xì)胞均呈指數(shù)增殖，Inhibitor組仍緩慢增殖。
　　4.MicroRNA-155 Inhibitor轉(zhuǎn)染至各肺腺癌細(xì)胞培養(yǎng)96小時行FCM檢測細(xì)胞周期顯示:較NC

23、組和Mock組，G0/G1期細(xì)胞比例增加而S期細(xì)胞比例下降(P＜0.05)。
　　5.MicroRNA-155 Inhibitor轉(zhuǎn)染至各肺腺癌細(xì)胞培養(yǎng)96小時后，EdU檢測陽性染色標(biāo)記細(xì)胞數(shù)，EdU陽性細(xì)胞數(shù)明顯低于NC組和Mock組，Inhibitor組細(xì)胞增殖率較另外兩組明顯降低(P＜0.05)
　　6.MicroRNA-155 Inhibitor轉(zhuǎn)染培養(yǎng)96小時后，AnnexinⅤ-FITC檢測細(xì)胞早期凋亡率較NC組

24、和Mock組有明顯增加(P＜0.05); TUNEL細(xì)胞原位雜交顯示晚期凋亡細(xì)胞比例明顯增加(P＜0.05)
　　7.MicroRNA-155 Inhibitor組侵移生長至Transwell小室膜外側(cè)的細(xì)胞數(shù)較相應(yīng)NC組和Mock組中侵移生長的細(xì)胞數(shù)明顯減少(P＜0.05)。
　　8.PTEN蛋白在各肺腺癌細(xì)胞Inhbitor轉(zhuǎn)染組的表達(dá)高于未轉(zhuǎn)染和非相關(guān)轉(zhuǎn)染對照組中的表達(dá)(P＜0.05)，PI3K在肺腺癌細(xì)胞Inhbit

25、or轉(zhuǎn)染組中的表達(dá)低于未轉(zhuǎn)染和非相關(guān)轉(zhuǎn)染對照組中的表達(dá)(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.肺腺癌患者腫瘤組織miR-155的表達(dá)較正常組織增高，不同分期腫瘤患者組織中miR-155有差異性表達(dá)。
　　2.肺腺癌病人血清中可穩(wěn)定連續(xù)檢測到miR-155的升高表達(dá)，以Ⅱ期患者中升高明顯。miR-155在患者血清中的差異性表達(dá)可以為肺腺癌的臨床早期診斷提供參考。
　　3.體外培養(yǎng)的肺腺癌細(xì)胞中可檢測到增高的miR-