抗PeroxiredoxinⅠ肺腺癌噬菌體抗體的制備、抑制肺腺癌細胞增殖研究及其在荷人肺腺癌裸鼠模型中的放免顯像.pdf

1、肺癌是目前世界上死亡率最高的惡性腫瘤之一，與20世紀初相比，現(xiàn)在肺癌已經(jīng)成為威脅人類健康和生命的最大敵人之一。目前肺癌的治療主要采取外科手術結合放療和化療的綜合治療。但肺癌早期少有癥狀或癥狀不明顯，因此導致患者出現(xiàn)癥狀就診者多屬中晚期，療效不佳。肺癌總的5年生存率在發(fā)達國家約為15％，我國低于10％。尋找新的治療手段成為提高腫瘤治療效果的突破口。其中，腫瘤的靶向治療具有良好的發(fā)展前景。腫瘤靶向治療強調治療的特異性，在殺傷腫瘤細胞的同時盡

2、可能保護正常細胞。其中，基于放射免疫治療的原理，將放射性核素偶聯(lián)靶向性特異抗體，可將抗體介導的細胞殺傷效應與放射性核素的治療作用結合起來，從而提高腫瘤治療的效果。
　　 靶向治療成功的關鍵在于抗體的制備及特異性靶點的選擇。作為最具應用潛力的單克隆抗體，經(jīng)歷了鼠源性抗體的人源化改造、小分子抗體及文庫展示抗體三個階段。其中，以噬菌體展示文庫抗體為代表的第三代抗體是基因工程抗體技術的新發(fā)展。
　　 細胞的氧化還原狀態(tài)與腫瘤的形

3、成密切相關，參與細胞氧化還原的蛋白可用于研究腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Peroxiredoxin蛋白是新近發(fā)現(xiàn)的一類過氧化物酶，在清除活性氧族中具有重要作用，可以保護細胞免受過氧化反應造成的膜損傷。PeroxiredoxinⅠ（PrxⅠ）是Peroxiredoxin蛋白家族成員之一，在肺腺癌細胞中高表達。PrxⅠ可以減少活性氧自由基的產生，其表達上調增強了腫瘤抗氧化能力，是抗凋亡和化療耐藥的重要原因。因此，PrxⅠ可以作為肺腺癌治療的特異性靶點

4、。
　　 為克服鼠源性單克隆抗體在人體應用時的異源性及治療中大分子抗體穿透力較差的弊端，針對肺腺癌細胞高表達的。PrxⅠ蛋白，我們嘗試利用噬菌體抗體庫技術構建肺腺癌相關人源單鏈抗體庫，制備抗PrxⅠ肺腺癌人源單鏈抗體，評價其抑制肺腺癌細胞生長的能力，并標記放射性核素后行荷人肺腺癌裸鼠放免顯像研究。
　　 目的：通過噬菌體展示技術制備抗PrxⅠ肺腺癌人源單鏈抗體并檢測抗體性能，抗體標記放射性核素行放射免疫顯像研究，評價肺癌

5、放免靶向治療的可行性，為肺癌的治療提供新的輔助手段。
　　 方法與結果：
　　 第一部分、噬菌體抗體文庫的構建
　　 1.人源單鏈抗體的制備：以肺腺癌病人癌旁淋巴結作為抗體B細胞來源，提取淋巴結總RNA。經(jīng)RT-PCR法擴增得到cDNA文庫。以cDNA為模板擴增VH和VL基因片段。再以VH和VL基因片段作為延伸連接肽的模板，分別用各自對應引物擴增VH-linker和VL-linker，再通過SOE-PCR反應擴增

6、得到scFv，引入酶切位點SfiⅠ和NotⅠ，膠回收PCR產物即得到scFv基因片段。結果表明，總RNA的電泳凝膠上可見2條帶18 S與28 S；VH基因的大小約為370 bp，VL基因的大小約為350 bp，組裝scFv基因大小約為750 bp。
　　 2.重組噬菌體載體pCANTAB-5E的制備：純化的單鏈抗體PCR產物分別經(jīng)SfiⅠ和NotⅠ雙酶切反應后，與噬菌體載體pCANTAB-5E進行拼接。電擊穿孔法將純化的拼接產物

7、轉化感受態(tài)大腸桿菌TG1，得到2.8×107cfu/μg克隆。行隨機質粒鑒定及雙酶切鑒定，陽性插入率為88％（44/50）。陽性質粒行基因序列分析檢測單鏈抗體的完整性。
　　 3.噬菌體抗體的表達：用2×YT培養(yǎng)液收集上述陽性質粒，在M13KO7輔助噬菌體感染條件下，無糖環(huán)境誘導scFv片段的噬菌體表達。
　　 第二部分、噬菌體抗體庫的篩選
　　 1.肺腺癌細胞株對抗體庫的篩選：先以正常人支氣管上皮細胞HBE16

8、負性篩選后，以肺腺癌A549細胞對噬菌體抗體庫進行3輪富集，對抗體庫富集前后滴度測定結果顯示噬菌體收獲率逐漸升高。
　　 2.PrxⅠ抗原對抗體庫的篩選：將經(jīng)A549細胞篩選的抗體庫進一步用PrxⅠ純化抗原進行3輪篩選富集。一共進行6輪篩選富集。第1輪噬菌體收獲率為1.3×10-6，第6輪噬菌體收獲率為2.3×104，是第1輪的180倍。
　　 3.可溶性scFv抗體的表達：將ELISA證實的強陽性噬菌體抗體株感染大腸桿

9、菌E.coliHB2151，經(jīng)IPTG（1 mmol/L）誘導培養(yǎng)后獲得可溶性scFv抗體。經(jīng)HitrapTM Anti-E Tag親和層析柱純化后得到純化的可溶性抗體。
　　 4.可溶性抗體的鑒定：SDS-PAGE檢測可溶性抗體：將可溶性抗體行SDS-PAGE檢測?？捡R斯亮藍R250染色后觀察可見在約30 ku處有條帶出現(xiàn)，證實scFv抗體片段在大腸桿菌HB2151中實現(xiàn)可溶性表達。細胞ELISA測定可溶性抗體的免疫活性：肺腺

10、癌細胞A549的A405 nm值0.63±0.08，乳腺癌細胞MDA-MB-435的A405 nm值0.36±0.05，正常支氣管上皮細胞HBE16的A405 nm值0.37±0.06。
　　 結果顯示，可溶性抗體具有較高的特異性，能與肺腺癌細胞A549結合?？贵w親和力測定：通過競爭ELISA評估可溶性抗體與A549細胞的親和力。結果顯示，當抗體1：250稀釋時，IgG的結合抑制率為4.5％；當抗體1：1稀釋時，結合抑制率增加到

11、66.1％。免疫細胞化學法測定可溶性抗體特異性：免疫細胞化學法檢測表明，與MDA-MB-435細胞和HBE16細胞比較，A549細胞明顯深染，證實scFv抗體與肺腺癌細胞A549特異性結合。
　　 第三部分、噬菌體抗體抑制肺腺癌細胞增殖研究
　　 1.可溶抗體內攝量測定：用氯胺T法將放射性核素標記抗體，純化后與肺腺癌A549細胞37℃孵育30 min和120 min。以未篩選的scFv及抗iASPP scFv（實驗室自備

12、）作為抗體對照，以4℃孵育條件作為溫度對照。孵育結束后PBS洗滌細胞，再以2％SDS溶解細胞，收集洗脫液和溶胞產物，分別測定洗脫液和溶胞產物的放射性計數(shù)。
　　 結果表明，相對于對照組，37℃條件下PrxⅠ特異性肺腺癌單鏈抗體能有效結合、進入細胞內。
　　 2.MTT及流式細胞術評價細胞增殖、凋亡情況：單鏈抗體作用于A549細胞72 h后進行MTT分析，發(fā)現(xiàn)抗體對細胞有劑量依賴的抗增殖作用。AnnexinV-FITC/P

13、I法流式細胞儀檢測A549細胞凋亡，抗體干預組細胞凋亡率較對照組明顯增加。
　　 3.PrxⅠ蛋白表達水平測定：單鏈抗體干預A549細胞72 h后，提取總蛋白，進行Western blot檢測。
　　 結果顯示，樣品組PrxⅠ蛋白表達水平低于對照組，證實可溶抗體干預后細胞PrxⅠ蛋白表達受到抑制，PrxⅠ表達量約為對照組的60％。
　　 第四部分、單鏈抗體的放射性核素標記及鑒定
　　 氯胺T法將131Ⅰ標

14、記可溶性單鏈抗體，經(jīng)Sephadex G200層析柱純化后測定抗體的放射性核素標記率、比活度、放射化學純度以及37℃條件下核素標記抗體與人血清孵育后放射化學純度變化。
　　 結果顯示，抗體的131Ⅰ標記率為83.2±6.5％，比活度為2.8±0.2MBq/μg，放射化學純度為95.6±3.7％。核素標記抗體與新鮮人血清孵育后測放射化學純度，第48 h測得值與第1 h比較無明顯降低，證實穩(wěn)定性較好。
　　 第五部分、核素標

15、記抗體在荷肺腺癌裸鼠模型體內的分布及SPECT顯像
　　 通過尾靜脈將核素標記的單鏈抗體注射荷人肺腺癌裸鼠，不同時間點處死裸鼠，測定腫瘤及各組織％ID/g（每克組織百分注射劑量率）。同樣裸鼠模型在不同時間點行SPECT顯像。
　　 結果顯示，注射131Ⅰ-scFv后，腫瘤組織對抗體的攝取量逐漸增加，荷瘤裸鼠模型的瘤/血、瘤/肌肉放射性比值逐漸升高，并在第48 h達到峰值（瘤/血、瘤/肌肉比值分別為4.19±0.13、4.

16、89±0.56）。通過SPECT顯像觀察到在腫瘤區(qū)域的放射性濃聚，腫瘤組織得以顯像，以第48 h時顯像最為清晰。
　　 結論：本研究利用噬菌體展示技術制備抗PrxⅠ肺腺癌人源單鏈抗體，檢測抗體性能及抑制肺腺癌細胞增殖能力，經(jīng)放射性核素標記后行體內分布研究及放免顯像。結果表明成功利用噬菌體展示技術制備全人源特異性肺腺癌相關單鏈抗體，該抗體能有效抑制肺腺癌細胞增殖。經(jīng)放射性核素標記的單鏈抗體符合放免顯像要求，靶向性較強，得到了較為滿