小鼠肺腺癌噬菌體抗體庫的構(gòu)建及靶向干細胞樣肺腺癌側(cè)群細胞單鏈抗體的初步篩選.pdf

1、肺癌是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，近年來隨著環(huán)境污染的加重和吸煙人群數(shù)量的快速增加，其發(fā)病率和死亡率逐年攀升。雖然目前針對肺癌的診斷技術(shù)和以手術(shù)、放化療為主的綜合治療方法取得了較大的進步，但總的5年生存率仍僅15％左右，尤以肺腺癌對放化療不敏感，易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，預后極差。肺腺癌預后惡劣的重要原因，一是缺乏有效的早期診斷方法，患者常因早期不能明確診斷而失去手術(shù)根治的機會；二是殘存對放化療不敏感的腫瘤細胞，導致腫瘤耐藥、復發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移。因此

2、，從肺腺癌發(fā)生的“起源”著手，探尋高效、特異的早期診斷和治療的新方法，已成為目前醫(yī)務工作者們關(guān)注和研究的熱點之一。
　　 近年來的研究表明，腫瘤是一種干細胞疾病。在腫瘤組織中存在一小群具有干細胞特性的細胞，能夠無限增殖和自我更新，產(chǎn)生大量的分化細胞，最終導致腫瘤形成。目前已從多種腫瘤組織中成功分離出腫瘤干細胞，包括白血病、黑色素瘤、腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌和結(jié)腸癌等。這些腫瘤干細胞具有無限增殖、自我更新和分化能力，被認

3、為是腫瘤發(fā)生的始動因素，也是腫瘤放化療抵抗、復發(fā)和侵襲轉(zhuǎn)移的根源。如能在腫瘤發(fā)生的始動階段找到針對腫瘤干細胞的靶向檢測和治療策略，則將大大推進腫瘤的早期診斷和治療，進而改善其預后。
　　 腫瘤靶向研究成功與否的關(guān)鍵在于靶點的選擇和抗體的制備。傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)不僅制備過程繁瑣、費時，而且產(chǎn)生的抗體具有分子質(zhì)量大、穿透能力弱、靶/非靶比值低、血清清除慢等缺陷。噬菌體展示技術(shù)的出現(xiàn)將基因工程抗體技術(shù)帶入了一個新的發(fā)展階段。它能在體外模

4、擬抗體生成過程，產(chǎn)生的單鏈抗體具有分子量小、免疫原性低，組織穿透力強以及血清清除快等優(yōu)點。
　　 因此，本課題擬嘗試應用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建小鼠肺腺癌單鏈抗體庫，并用小鼠干細胞樣肺腺癌側(cè)群(side population，SP)細胞對文庫進行初步篩選，探索制備靶向肺腺癌干細胞抗體的新途徑，為靶向肺腺癌干細胞的早期診療手段提供新的思路。
　　 目的：通過噬菌體抗體展示技術(shù)制備靶向小鼠干細胞樣肺腺癌側(cè)群細胞的單鏈抗體，并初步研

5、究其免疫學活性，為探尋靶向肺腺癌干細胞樣細胞的的早期診療手段奠定基礎(chǔ)。
　　 方法與結(jié)果：
　　 第一部分小鼠干細胞樣肺腺癌側(cè)群細胞的分離和鑒定
　　 1.小鼠肺腺癌SP細胞的分選：取對數(shù)生長期的小鼠Lewis肺腺癌(Lewis lung cancer，LLC)細胞，利用Hoechst33342和Propidium iodide(PI)雙染流式分選LLCSP細胞，并將其懸浮培養(yǎng)于含有bFGF、EGF和胰島素的無血

6、清培養(yǎng)基。
　　 2干細胞樣.LLC SP細胞的鑒定：利用體外培養(yǎng)成球?qū)嶒?、MMT檢測增殖、克隆形成實驗、耐藥實驗、誘導分化實驗和體內(nèi)成瘤實驗檢測分選出來的SP和non SP細胞的自我更新和分化能力，并用RT-PCR檢測相關(guān)干細胞標志物的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對于non-SP細胞，SP細胞可在無血清培養(yǎng)基中懸浮成球生長，在含血清培養(yǎng)基中可誘導分化為貼壁細胞，具有更強的增殖能力、耐藥能力和致瘤能力，并高表達CD44、ABCG2和O

7、CT-4等干細胞相關(guān)標志物，表明LLC SP細胞具有干性。
　　 第二部分小鼠肺腺癌噬菌體抗體庫的構(gòu)建
　　 1.條件性基因敲除小鼠肺腺癌模型的建立：大量擴增重組腺病毒AdCre后，利用鼻腔吸入法感染Lox-stop-lox K-ras G12D小鼠，5天一次，重復3次，30天后處死小鼠，取全肺組織固定、包埋、切片后進行HE染色。鏡下觀察可見小鼠肺組織出現(xiàn)重度不典型增生，并有散在癌巢。
　　 2.小鼠肺腺癌單鏈抗

8、體庫的構(gòu)建：以發(fā)生肺腺癌的Lox-stop-lox K-ras G12D小鼠脾臟組織作為B細胞的來源，提取脾臟總RNA。根據(jù)文獻設(shè)計引物，用RT-PCR的方法擴增抗體重鏈(VH)和輕鏈(VL)可變區(qū)基因。利用SOE-PCR技術(shù)將它們與Linker拼接，再引入酶切位點SfiⅠ和NotⅠ，純化回收SOE-PCR產(chǎn)物即得到scFv基因。結(jié)果顯示：提取的脾臟總RNA進行瓊脂糖電泳，可見清晰的28S、18S條帶；擴增的VH基因共5條，大小約350

9、bp，VL基因共4條，大小約320bp，拼接組裝后的scFv基因共20條，大小約為750bp。
　　 3.scFv基因與噬菌粒載體pCANTAB-5E的拼接和鑒定：純化的scFv基因經(jīng)SfiⅠ和NotⅠ雙酶切后，膠回收純化，與同樣經(jīng)SfiⅠ和NotⅠ雙酶切的噬菌粒載體pCANTAB-5E連接。連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1感受態(tài)細胞，獲得庫容為1.7×108的抗體庫。隨機進行挑取單克隆進行PCR和酶切鑒定，陽性插入率為86.36％

10、(19/22)。
　　 4.噬菌體抗體庫的展示：對上一步鑒定有陽性克隆的電轉(zhuǎn)產(chǎn)物進行M13K07輔助噬菌體超感染，在無糖環(huán)境下誘導單鏈抗體庫的噬菌體展示。重組噬菌體抗體庫的滴度達到1012cfu/ml。
　　 第三部分小鼠干細胞樣肺腺癌側(cè)群細胞噬菌體單鏈抗體的初步篩選
　　 1.LLC SP細胞對抗體庫的富集：先以小鼠肺腺癌LLC細胞對抗體庫進行負性篩選后，再用分選得到的干細胞樣LLC SP細胞對噬菌體抗體庫進行

11、正性篩選，共進行了4輪富集。對噬菌體抗體庫富集前后滴度測定結(jié)果表明，收獲的噬菌體滴度逐漸升高。第1輪淘篩噬菌體收獲率為1.37×10-9，第4輪為2.47×10-7，第4輪收獲率約為第1輪的180倍。
　　 2.細胞ELISA檢測噬菌體抗體的免疫活性：用細胞ELISA測定篩選到的噬菌體抗體抗原結(jié)合活性及特異性，結(jié)果顯示有5個噬菌體抗體具有較高的結(jié)合能力和特異性，能與干細胞樣LLC SP細胞結(jié)合，P/N值大于2。
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12、.免疫組化檢測噬菌體抗體的免疫活性：用免疫組化進一步檢測ELISA陽性噬菌體抗體抗原結(jié)合活性及特異性，陽性克隆所展示的抗體可與干細胞樣LLC SP細胞結(jié)合，DAB顯色呈棕色深染。
　　 結(jié)論：本研究通過噬菌體抗體展示技術(shù)制備靶向小鼠干細胞樣肺腺癌側(cè)群細胞的單鏈抗體，并通過ELISA和免疫組化方法進行了初步驗證，結(jié)果表明利用噬菌體展示技術(shù)直接從肺腺癌小鼠脾臟中獲得RNA，制備單鏈抗體，較傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)方法更為簡便、省時。初步鑒定