鼠源性人腫瘤單鏈抗體庫的構建及乳腺癌相關抗體的篩選.pdf

1、本研究是本室構建抗體庫平臺的一個組成部分。通過鼠源性人腫瘤單鏈抗體庫的構建及腫瘤相關抗體的篩選，旨在有助于本室更好地開展腫瘤分子生物學的研究工作，有助于腫瘤的診斷與治療。 實驗首先用乳腺癌細胞系MCF-7、T47D、MDA-MB-435免疫BALB/c小鼠，待達到合適免疫效價后取鼠脾臟淋巴細胞提取總RNA，通過RT-PCR反轉錄成cDNA，利用鼠VH、VL特異性引物擴增出VH、VLcDNA，并用Linker連接VH、VL，構成單

2、鏈抗體(scFv)基因片段，隨后將單鏈抗體(scFv)基因片段插入pCANTAB5E載體，電轉化TG1菌，獲得庫容為1.3×106的單鏈抗體庫。 在用抗體庫篩選實驗中，主要選乳腺癌細胞系MCF-7和人正常肝細胞系HL02做正負差異篩選模型，運用固相和液相篩選方法，篩選到兩株腫瘤相關抗體：scFv-873和scFv-874。通過數據庫搜索，發(fā)現這兩株單鏈抗體基因是與以往抗體序列不同的新基因。 將含這兩種抗體基因的噬菌粒載體

3、轉入琥珀密碼子非抑制型菌株TOP10中，誘導表達后，用Westernblot檢測，scFv-874具有明顯的分泌性表達，并且在周質及全細胞中都可以表達；而scFv-873未檢測出明顯的分泌性表達，只在全細胞中可以表達。遂將這兩個scFvs基因插入pTIG-Trx表達載體中，在BL21(DE3)中實現了游離形式的可溶性表達，并經鎳柱(Ni-NTA)得到有效純化。 本研究獲得了針對人腫瘤細胞的相關抗體，并實現了可溶性表達和純化，為下