蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選肺癌相關(guān)蛋白及人源性肺癌單鏈抗體庫的構(gòu)建.pdf

1、鄭州大學(xué)博士學(xué)位論文蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選肺癌相關(guān)蛋白及人源性肺癌單鏈抗體庫的構(gòu)建姓名：張慧珍申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：病理與病理生理學(xué)指導(dǎo)教師：吳逸明20050508鄭州大學(xué)博士學(xué)位論文蛋白質(zhì)紐學(xué)方法篩選肺癌相關(guān)蛋白及人源性肺癌單鏈抗體庫的構(gòu)建組分析型雙向電泳圖譜，用GS一800圖像掃描儀獲得凝膠圖像，經(jīng)PDQuest凝膠圖像分析軟件進(jìn)行圖像調(diào)整、點(diǎn)檢測、點(diǎn)匹配、數(shù)據(jù)分析后，找出差異蛋白點(diǎn)。l_3將差異蛋白點(diǎn)的特異蛋白從制各型凝膠上挖下，膠

2、內(nèi)酶解后，經(jīng)基質(zhì)輔助電離解析飛行時(shí)問質(zhì)譜(MALDI—TOFMS)獲得肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)，搜尋蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫并聯(lián)合生物信息學(xué)，鑒定蛋白質(zhì)，分析蛋白的生物學(xué)意義和生物學(xué)功能，作為肺癌標(biāo)志物的候選蛋白。2人源性肺癌單鏈抗體庫的構(gòu)建21反轉(zhuǎn)錄PCR(RTPCR)擴(kuò)增肺癌患者轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中抗體輕鏈可變區(qū)基因VL和重鏈可變區(qū)基因VH，酶切PCR產(chǎn)物，用磷酸化的Linker將兩者連接，再與噬菌粒DCANTAB5E進(jìn)行雙酶切連接，電擊轉(zhuǎn)化處于感受態(tài)

3、的大腸桿菌TGl，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選后，形成噬菌體表面展示的單鏈抗體庫。22制備抗體庫上清液，PEG沉淀濃縮，檢查上清噬菌體抗體滴度，同時(shí)擴(kuò)增輔I坊噬菌體KMl3。3肺癌相關(guān)蛋白熱休克蛋白70(HSP70)的純化、鑒定31肺癌組織加入裂解液經(jīng)過勻漿、超聲破碎以及100，0009超速離心后，得到的上清為肺癌組織蛋白。將ConA凝膠填料裝柱，制成lml柱體積的ConA親和層析柱，首先平衡親和柱，將提取好的蛋白質(zhì)過柱，進(jìn)行親和層析，收集不結(jié)

4、合蛋白部分。32將收集到的蛋白成分置于滲透液中，過夜透析后在快速蛋白液相色譜系統(tǒng)中進(jìn)行DEAE離子交換層析。平衡DEAE預(yù)裝柱，上樣透析過的蛋白，進(jìn)行梯度洗脫，接收組分，凍干。33用SDS—PAGE電泳確認(rèn)得到的蛋白組分分子量，分子量在70KD附近的應(yīng)該確認(rèn)為HSP70，并標(biāo)記組分蜂，作為下次純化的依據(jù)。再用Westernblot方法，鑒定其免疫原性。以純化的HSP70為抗原對抗體庫進(jìn)行4輪吸附一洗脫一擴(kuò)增的篩選得到含有融合抗體的富集抗