STAT3在人肺腺癌細(xì)胞中的活化與肺腺癌發(fā)生機制的研究.pdf

1、目的檢測信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3(Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、細(xì)胞周期素D1(CyclinD1)、細(xì)胞周期素B1(CyclinB1)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病基因-2(Bcl-2)在人肺腺癌細(xì)胞A549和正常人胚肺細(xì)胞HELF中的表達(dá)，探討STAT3，CyclinD1，CyclinB1，Bcl-2蛋白在肺癌發(fā)病機制中的作用。方法1.細(xì)胞培養(yǎng)(cell c

2、ulture):配置好細(xì)胞培養(yǎng)所需的各種液體后，復(fù)蘇人肺腺癌細(xì)胞A549和正常人胚肺細(xì)胞HELF，人肺腺癌細(xì)胞A549培養(yǎng)于含10％的小牛血清，100U/L青霉素，100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，正常人胚肺細(xì)胞HELF培養(yǎng)于含20％的胎牛血清，100U/L青霉素，100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，24h后見人肺腺癌細(xì)胞A549和正常人胚肺細(xì)胞HELF貼壁，說明復(fù)蘇成功，繼續(xù)傳代培養(yǎng)，人肺腺癌細(xì)胞A549

3、每2-4天傳代一次，正常人胚肺細(xì)胞HELF每4-6天傳代1次。2.裂解細(xì)胞提取蛋白:在每瓶細(xì)胞中加入300ul細(xì)胞裂解液，用槍尖吹打混勻，冰上裂解30min，離心4℃， 12000 rpm × 20min，收集上清蛋白。3.蛋白免疫印跡法(Western-blot):分別檢測兩組細(xì)胞中的Stat3,CyclinD1,CyclinB1,Bcl-2蛋白:用BCA試劑盒測定樣品總蛋白濃度、聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、考馬斯亮藍(lán)染色

4、觀察蛋白條帶、電轉(zhuǎn)移(electrotransfer)、封閉PVDF膜、免疫反應(yīng)(加入一抗和二抗)、化學(xué)發(fā)光顯示目的條帶。4.圖像分析:將Western-blot結(jié)果掃描傳送至計算機，用Image-Proplus圖像分析軟件系統(tǒng)對蛋白條帶進行分析，以蛋白條帶的灰度值代表蛋白的表達(dá)量，用β-actin條帶灰度值進行校正，得出各條帶的相對灰度值。分析兩組細(xì)胞中蛋白表達(dá)的差異以及在人肺腺癌細(xì)胞A549中Stat3蛋白與CyclinD1，Cyc

5、linB1，Bcl-2蛋白表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果:1)人肺腺癌細(xì)胞A549中Stat3,CyclinD1,CyclinB1,Bcl-2蛋白的表達(dá)水平均明顯高于正常人胚肺細(xì)胞HELF,Stat3蛋白在兩組細(xì)胞的表達(dá)具有顯著差異(P=0.037<0.05)，CyclinD1在兩組細(xì)胞中的表達(dá)有顯著差異(P=0.019<0.05)，CyclinBl在兩組細(xì)胞的表達(dá)有顯著差異(P=0.038<0.05)，Bcl-2在兩組細(xì)胞中的表達(dá)有顯著差異(P=

6、0.029<0.05)。2)經(jīng)Person相關(guān)性分析顯示:在人肺腺癌細(xì)胞A549中STAT3與CyclinDl表達(dá)呈線性相關(guān)(r==0.888，P=0.044<0.05)；在人肺腺癌細(xì)胞A549中STAT3與Bcl-2表達(dá)呈線性相關(guān)(r=0.949，P=0.014<0.05)；而在人肺腺癌細(xì)胞A549中STAT3與CyclinB1表達(dá)相關(guān)性無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.789>0.05)。 結(jié)論:1)Stat3蛋白在人肺腺癌細(xì)胞A549

7、的表達(dá)水平均明顯高于正常人胚肺細(xì)胞HELF，提示Stat3的過度表達(dá)可能在NSCLC的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用；2)CyclinD1蛋白在在人肺腺癌細(xì)胞A549中的表達(dá)水平均明顯高于正常人胚肺細(xì)胞HELF，提示CyclinD1的過度表達(dá)可能在NSCLC的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用；3)CyclinB1蛋白在人肺腺癌細(xì)胞A549的表達(dá)水平均明顯高于正常人胚肺細(xì)胞HELF，提示CyclinB1的過度表達(dá)可能在NSCLC的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用；4

8、)Bcl-2蛋白在人肺腺癌細(xì)胞A549中的表達(dá)水平均明顯高于正常人胚肺細(xì)胞HELF，提示Bcl-2的過度表達(dá)可能在NSCLC的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用；5)在人肺腺癌細(xì)胞A549，Stat3蛋白的表達(dá)與CyclinD1蛋白的表達(dá)成線性相關(guān)，其可能機制是Stat3與Cyclin D1啟動子上的Stat3位點結(jié)合而啟動轉(zhuǎn)錄，促進癌細(xì)胞增殖而導(dǎo)致肺癌發(fā)生，由此可望尋找到NSCLC新的診斷方法和治療靶點6)在人肺腺癌細(xì)胞A549中，Stat3蛋白