膠原蛋白亞型在肺腺癌細胞中的表達及意義.pdf

1、目前惡性腫瘤仍是威脅人類生存的天敵,到2010年,癌癥死亡率將超過心臟病,成為全球頭號殺手。而肺癌已成為全球發(fā)生率最高的惡性腫瘤之一,在北美,肺癌的死亡率居各大腫瘤之首,甚至超過乳腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌死亡率的總和。在我國,肺癌的發(fā)病率死亡率也迅速上升。在癌癥相關(guān)的死亡病例中90％是由于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移引起的,而肺腺癌晚期時常發(fā)生胸腔轉(zhuǎn)移形成胸水。在長期的臨床細胞病理論斷當中經(jīng)過大量的細胞形態(tài)學觀察我們發(fā)現(xiàn)在肺腺癌的一些細胞學標本中癌細

2、胞的胞漿內(nèi)有一些圍繞胞核成蔥皮狀改變的纖維樣結(jié)構(gòu),尤以惡性胸水中的腺癌細胞為甚。從肺腺癌細胞形態(tài)學上的觀察引發(fā)了我們的一個假設(shè):肺癌胸水中的中晚期肺腺癌細胞是不是同某些發(fā)生了纖維化的器官組織一樣發(fā)生了纖維化、膠原化而分泌膠原蛋白?
　　 為驗證這一假設(shè),我們利用不同的實驗方法對膠原蛋白(Collagen protein)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型進行檢測。
　　 材料與方法：
　　 1、材料
　　 (1)臨床資料200

3、7年7月至2009年9月中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科液基薄層細胞學檢查(Thin-layer cytology test,TCT)涂片數(shù)千例篩選出做過細胞包埋蠟塊124例。所有患者術(shù)前未經(jīng)任何治療。這些病例結(jié)合臨床病史、影像學診斷及細胞病理證實為肺腺癌的共112例,其中胸水72例,痰標本20例,支氣管肺泡灌洗液(BALF)標本20例；另有對照12例為良性胸腔積液。
　　 (2)細胞沉渣標本經(jīng)診斷為肺腺癌的胸水、痰、肺泡灌洗液脫

4、落細胞離心取沉渣,將沉渣轉(zhuǎn)移至EP管,放-70℃冰箱凍存:來自于胸水增生上皮沉渣的收集同上。
　　 (3)主要試劑 羊抗人COL1A1 COL3A1多克隆抗體、鼠抗人COL2A1單克隆抗體(SantaCruze,美國),兔抗山羊、羊抗鼠二抗(北京中杉金橋),鼠抗人CK19、TTF-1、Vimentin單克隆抗體(Bio Genex,美國),S-P組化試劑盒,masson氏改良三色染料(廈門邁威生物科技有限公司)。
　　

5、2、方法
　　 (1)masson特殊染色石蠟細胞學切片常規(guī)烤片,脫蠟,水化；A試劑(蘇木素染色液)染色5分鐘,鹽酸酒精分色,水沈返藍； B試劑(masson氏改良三色染料)常溫過夜,水洗至無染料脫落； C試劑(0.2％冰醋酸溶液)洗30秒；梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片；顯微鏡下觀察。
　　 (2)免疫細胞化學技術(shù)石蠟包埋細胞學標本4 μ m厚切片常規(guī)烤片、脫蠟、水化,采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶法(St

6、reptavidin-peroxidase,S-P)按說明書行免疫組化染色。COL1A1、COL2A1、COL3A1-抗稀釋濃度均為1:50,二抗?jié)舛?:500,CK19、TTF-1、Vimentin抗體均為即用型抗體。以PBS代替-抗做陰性對照。
　　 (3)Westernblot技術(shù)總蛋白從收集的細胞沉渣標本中提取,以牛血清蛋白作為標準進行蛋白定量,計算各樣品蛋白濃度,取等量蛋白,進行SDS-PAGE和轉(zhuǎn)印,分別孵育-抗(C

7、OL1A1、COL2A1、COL3A11:500稀釋)4℃過夜,相應(yīng)二抗(1:5000)37℃孵育2h,ECL發(fā)光。以β-actin為內(nèi)參照。
　　 3、統(tǒng)計學分析
　　 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件進行分析,膠原纖維在肺腺癌不同細胞學標本中的表達率采用卡方檢驗,Collagen protein亞型之間的相關(guān)性采用非參數(shù)Spearman等級相關(guān)分析,P<0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果：
　　 1

8、、液基薄層細胞學檢查觀察到有纖維蔥皮樣結(jié)構(gòu)存在的腫瘤細胞均為肺腺癌細胞且有間質(zhì)細胞的特征 經(jīng)過TCT,我們在數(shù)千例惡性腫瘤細胞胞漿中觀察到一些圍繞胞核呈蔥皮樣改變的纖維樣結(jié)構(gòu),而在良性胸水增生的上皮細胞中始終沒發(fā)現(xiàn)這種結(jié)構(gòu)。在細胞石蠟包埋切片的HE染色中這種結(jié)構(gòu)更加凸顯的出現(xiàn)在腫瘤細胞中,甚至有的腫瘤細胞核已經(jīng)消失,完全被這種膠原纖維結(jié)構(gòu)取代,進一步做了免疫細胞化學染色TTF-1、CK19和Vimentin,證實了這些腫瘤細胞均為肺腺癌

9、細胞并且具有間質(zhì)細胞的特征。
　　 2、膠原纖維在肺腺癌的不同細胞學標本中的表達情況 masson特殊染色顯示膠原纖維在胸腔積液肺腺癌細胞中的表達率為59.70％(43/72),在痰及支氣管肺泡灌洗液的腺癌細胞中表達率分別為20％(4/20)、30％(6/20),在良性胸腔積液增生上皮中不表達(0/12),在胸水中肺腺癌細胞的陽性率要顯著高于在痰和肺泡灌洗液中肺腺癌細胞的陽性率(P<0.05),陽性表達為在腫瘤細胞胞漿或胞膜內(nèi)成

10、一種亮綠色或藍色。
　　 3、膠原蛋白亞型在肺腺癌細胞中的表達及相關(guān)性
　　 (1)膠原蛋白免疫細胞化學結(jié)果
　　 膠原蛋白各亞型間表達關(guān)系免疫細胞化學結(jié)果顯示:COL1A1、COL2A1和COL3A1在肺腺癌細胞中的陽性表達率分別為22.6％(28/124),5.6％(7/124),22.6％(28/124),陽性表達主要定位于胞漿,而在增生的上皮細胞中不表達,統(tǒng)計學分析結(jié)果顯示COL1A1、COL3A1的表達

11、率要顯著高于COL2A1的表達率(P=0.024),并且我們發(fā)現(xiàn)COLA1與COL3A1的表達成正相關(guān)性(r=0.908,P=0.045)。
　　 (2)Western-blot結(jié)果
　　 Western-blot法檢測膠原蛋白亞型在肺腺癌細胞中的表達參照DNA分子量標準,肺腺癌細胞中可見在130KD,190KD,110KD附近有特異性條帶,對應(yīng)位置分別為COL1A1,COL2A1,COL3A1,而在良性胸水增生上皮中表