miR-96介導的FOXO3表達變化對肺腺癌細胞A549增殖和凋亡的影響.pdf

1、背景:
　　目前，在世界范圍內(nèi)，肺癌是發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，它的病理類型主要分為兩種:一是進展速度較快的小細胞癌(smallcelllungcarcinoma，SCLC)，占總體比例的13-15％左右，二是非小細胞癌(non-smallcelllungcarcinoma，NSCLC)，包括腺癌、鱗癌，大細胞癌，神經(jīng)內(nèi)分泌癌等，占總體比例的85％左右，其中腺癌是發(fā)病率最高的肺癌。導致肺癌預后較差的原因有很多方面，大部分患

2、者發(fā)現(xiàn)肺癌時已處于晚期是預后差的關(guān)鍵因素之一，因此早期發(fā)現(xiàn)和手術(shù)仍然是治療效果最好的措施。對于中晚期的肺癌患者，主要的治療手段有化學藥物治療、放射性治療、生物靶向治療等。這些治療手段有一定的療效，但患者耐受性差、副作用大、容易復發(fā)，特別是化學藥物治療、放射性治療。肺癌的浸潤和轉(zhuǎn)移也是影響患者療效和生存時間的關(guān)鍵因素，明確的發(fā)病和轉(zhuǎn)移機制目前仍然不清楚，因此缺乏有效的治療手段。由于肺癌發(fā)病率高，預后差，目前缺乏有效的治療手段，積極探索肺癌

3、發(fā)發(fā)展的生物學機制，對于早期診斷、減少復發(fā)和轉(zhuǎn)移，以及治療肺癌的新方新策略均具有現(xiàn)實意義。
　　微小RNA，即microRNA(miRNA)，是由22個左右的核糖核苷酸組成的非編碼、小分子單鏈RNA，在物種間和進化上具有高度保守性，幾乎所有的真核細胞生物都可以表達。MicroRNA以完全或者不完全互補結(jié)合的方式與mRNA的3'端非編碼區(qū)(3'-UTR)相互作用，促進mRNA降解，抑制mRNA翻譯。MicroRNA對很多基因都有調(diào)控

4、作用，在細胞的生長發(fā)育、分化、增殖、凋亡、細胞周期等細胞生物學行為都起著十分重要的作用。近年越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，在很多腫瘤組織和腫瘤患者血清中，miRNA有過表達或者低表達的現(xiàn)象，并且繪制了不同腫瘤組織的miRNA表達譜。進一步的研究表明，miRNA在肺瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用。miRNA-96是miRNA-183家族(miRNA-96，miRNA-182，miRNA-183)成員，在進化上高度保守，位于人類7號染色上。FOX03

5、屬于FOX0s家族(Fox01，F(xiàn)ox03，F(xiàn)ox04andFox06)，這一類轉(zhuǎn)錄因子的特點是鮮明的叉頭DNA結(jié)合域。FOX03的異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，癌癥中常見的是FOX03基因的下調(diào)，因此FOX03被稱為腫瘤抑制器。生物學信息分析FOX03的3'-UTR具有2個序列保守的miRNA-96的結(jié)合位點，結(jié)合后抑制FOX03的表達。在人乳腺癌組織中和乳腺癌細胞系中高表達的miRNA-96通過下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子FOX03起到促進腫

6、瘤細胞增殖的作用。在人肝細胞癌中miRNA-96的表達抑制可以增加FOX01、FOX03的表達水平，以此減少肝癌細胞系的增殖和集落形成。在非小細胞肺癌(non-smallcelllungcarcinoma，NSCLC)組織和相應患者血清中，已有證實miRNA-96持續(xù)和顯著高表達。WangyuZhu等人利用70對NSCLC組織和相匹配的癌旁組織、44例正常人血清樣本，驗證了miRNA-183家族（包括miRNA-96）在癌組織中、患者血

7、清中高表達，并且在肺腺癌細胞系A(chǔ)549、H1299、SPC-A1，肺小細胞癌細胞系NCI-H466，肺大細胞癌細胞系NCI-H460中表達增高。miRNA-96在NSCLC組織中及血清中研究報道較多，但在細胞水平及其下游作用靶點國內(nèi)外研究較少。
　　目的:
　　探討miRNA-96對人肺腺癌細胞系A(chǔ)549增殖和凋亡能力的影響及其對FOX03的調(diào)控作用。
　　方法:
　　1.細胞培養(yǎng)及miRNA-96inhibit

8、or設(shè)計人肺腺癌細胞系A(chǔ)549用DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清培養(yǎng)，miRNA-96inhibitor由上海生工生物公司設(shè)計并合成。
　　2.細胞轉(zhuǎn)染采用電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)將miRNA-96inhibitor轉(zhuǎn)入A549細胞內(nèi)。實驗分組三組:實驗組（miRNA-96inhibitor），對照組(scramble)，空白組(blank)。轉(zhuǎn)染后24～48小時后進行相關(guān)實驗及指標檢測。
　　3.指標檢測采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-P

9、CR)技術(shù)檢測干擾后細胞內(nèi)FOX03mRNA的表達量，采用westernblotting技術(shù)檢測干擾后FOX03蛋白質(zhì)的表達量，CCK-8技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后細胞增殖能力，采用細胞劃痕實驗檢測轉(zhuǎn)染后細胞遷移能力，采用流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后細胞凋亡情況。
　　4.統(tǒng)計學處理采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。該實驗采用單因素方差分析進行統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果:
　　1.轉(zhuǎn)染后，F(xiàn)OX03mRNA及FOX03蛋白質(zhì)表達量均顯著增高RT

10、-PCR結(jié)果顯示實驗組FOX03mRNA的表達量顯著高于對照組和空白組。Westernblotting結(jié)果顯示FOX03蛋白質(zhì)的表達量顯著高于對照組和空白組。
　　2.細胞遷移能力細胞劃痕實驗結(jié)果顯示，實驗組細胞遷移距離小于對照組和空白組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而對照組和空白組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　3.細胞增殖能力CCK-8試驗結(jié)果顯示，實驗組細胞增殖率顯著小于對照組和空白組，差異具有統(tǒng)計

11、學意義（P＜0.05），而對照組和空白組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　4.細胞凋亡流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，實驗組細胞凋亡率顯著高于對照組和空白組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而對照組和空白組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.將特異性的miRNA—96inhibitor轉(zhuǎn)染入A549細胞內(nèi)，可促進FOX03mRNA及蛋白質(zhì)的表達。
　　2.FOX03表達上調(diào)后，A549的