人細(xì)胞色素P450CYP2A13介導(dǎo)下姜黃素對肺腺癌A549細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的:用不同濃度的姜黃素作用于肺腺癌A549空載體細(xì)胞株(A549CYP(-))和肺腺癌A549過表達株(A549CYP)，觀察姜黃素對A549CYP(-)和A549CYP細(xì)胞增殖的作用和周期的影響，檢測對細(xì)胞中Bax和Bcl-2基因表達水平和蛋白表達水平的影響。為探討姜黃素抗腫瘤的作用機制及潛在的臨床治療方案提供新的理論基礎(chǔ)。
　　方法:(1)MTT（四氮唑藍）法檢測A549CYP（-）與A549CYP生長5天的吸光度值:取處于

2、對數(shù)生長期的兩組細(xì)胞，以2×103/孔接種于96孔板，每天各取3孔加入20μL(5mg/mL)MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后每孔加入DMSO200μL，使結(jié)晶充分溶解。連續(xù)5天觀察兩種細(xì)胞生長情況。(2)MTT法檢測不同濃度姜黃素作用后A549CYP（-）與A549CYP細(xì)胞的生長情況:取對數(shù)生長期的A549CYP（-）和A549CYP細(xì)胞接種于96孔板，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×104/mL，每孔200μL。分別選取姜黃素終濃度為(0、5、10、

3、20、40)μg/mL的培養(yǎng)液作用于A549CYP（-）和A549CYP細(xì)胞，每個濃度設(shè)6個復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48小時后，采用MTT法檢測計算細(xì)胞增殖抑制率，用酶標(biāo)儀測定490nm處吸光度值。(3)分別用不同濃度的姜黃素(0、10、40)μg/mL的培養(yǎng)液作用于A549CYP（-）和A549CYP細(xì)胞48小時，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)PI染色法檢測在不同條件作用下細(xì)胞的細(xì)胞周期變化情況。(4)用實時熒光定量PCR

4、法檢測不同濃度的姜黃素(0、10、40)μg/mL的培養(yǎng)液作用于A549CYP（-）和A549CYP細(xì)胞48小時，細(xì)胞中Bax和Bcl-2基因表達水平的變化情況。(5)應(yīng)用蛋白質(zhì)印記(Western blot)技術(shù)檢測在不同姜黃素濃度(0、10、40)μg/mL干預(yù)48小時后，細(xì)胞內(nèi)Bax和Bcl-2的蛋白水平表達情況。
　　結(jié)果:(1)MTT法檢測連續(xù)5天增殖的兩組細(xì)胞生長情況顯示:兩組細(xì)胞增殖速率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.0

5、5)。(2)MTT法測定在不同濃度的姜黃素干預(yù)48小時后A549CYP（-）和A549CYP細(xì)胞的存活和生長情況顯示:①隨著濃度的增加姜黃素對細(xì)胞生長的抑制愈加明顯，兩對照組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。②同一濃度不同細(xì)胞之間兩兩比較，差異顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(3)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布情況顯示:在不同濃度的姜黃素干預(yù)48小時后，A549CYP（-）和A549CYP細(xì)胞的細(xì)胞周期中G1期細(xì)胞百分比

6、均隨著姜黃素濃度的升高而增加(P＜0.05)，不同細(xì)胞兩對照組之間相比升高不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);相同濃度之間實驗組兩兩對比，A549CYP（-）細(xì)胞組比A549CYP細(xì)胞組G1期細(xì)胞百分比升高明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(4)實時熒光定量PCR結(jié)果顯示:①不同濃度的姜黃素作用于A549CYP（-）和A549CYP細(xì)胞48小時后，細(xì)胞中Bax基因的表達水平均上調(diào)，Bcl-2的基因表達水平均下調(diào)。②兩對照組之

7、間比較，Bax和Bcl-2的基因表達水平無顯著性差異(P＞0.05)，實驗組不同細(xì)胞同一藥濃度之間兩兩比較差異明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(5)姜黃素處理A549CYP（-）和A549CYP細(xì)胞48小時后，用Western blot技術(shù)檢測Bax和Bcl-2的蛋白表達水平。結(jié)果表明，經(jīng)姜黃素處理，對照組的兩種細(xì)胞Bax和Bcl-2的表達水平無顯著性差異(P＞0.05)，隨著姜黃素濃度的增加，Bax的表達上調(diào)，Bcl-2的表達

8、下調(diào)，同一濃度不同細(xì)胞之間兩兩比較，Bax和Bcl-2的蛋白表達水平差異明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:①人肺腺癌A549CYP（-）和A549CYP這兩種細(xì)胞在沒有藥物干預(yù)的情況下，生長速度無明顯差別，CYP2A13基因并未對細(xì)胞的增殖產(chǎn)生影響。②采用藥物姜黃素對人肺腺癌A549CYP（-）和A549CYP細(xì)胞進行干預(yù)48小時后發(fā)現(xiàn)，姜黃素對這兩種細(xì)胞的增殖均有明顯的抑制作用，且對肺腺癌A549CYP（-）細(xì)