ZIC1基因?qū)ξ赴┘?xì)胞肺轉(zhuǎn)移和腹腔種植轉(zhuǎn)移的作用及機制研究.pdf

1、研究目的：胃癌是全球高發(fā)的惡性腫瘤之一，其死亡率占居我國腫瘤死因第二位。胃癌就診的患者大多處于胃癌的中晚期，且多數(shù)已出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移，針對已發(fā)生轉(zhuǎn)移的胃癌病人一般采取化療。為了提高化療藥的治療效果，分子靶向治療起到了很大的作用。尋找胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)生物靶標(biāo)和潛在的治療靶點具有重要臨床意義。
　　ZIC1是我們課題組篩選到的在胃癌中低表達(dá)，具有潛在抑癌作用的基因。它屬于ZIC基因家族成員，位于人類3號染色體，具有Cys2His2鋅指結(jié)構(gòu)域，

2、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是重要的鋅指轉(zhuǎn)錄因子。ZIC1基因不僅在腦和神經(jīng)嵴發(fā)育、骨骼發(fā)育過程中起重要作用，它還與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如子宮內(nèi)膜癌、甲狀腺癌、髓母細(xì)胞瘤、間葉組織腫瘤、胃腸道腫瘤等。我們前期研究發(fā)現(xiàn)在體外實驗中，ZIC1具有抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的重要功能。但在體內(nèi)實驗中ZIC1基因?qū)ξ赴┠[瘤生長、形成和轉(zhuǎn)移的作用如何？它怎樣通過調(diào)控下游基因的表達(dá)影響腫瘤轉(zhuǎn)移的具體分子機制仍需進一步深入研究。
　　我們通過構(gòu)建裸鼠皮下

3、移植瘤及不同胃癌轉(zhuǎn)移瘤模型，研究過表達(dá)ZIC1對胃癌生長、形成、血行轉(zhuǎn)移和腹腔種植轉(zhuǎn)移的影響。采用基因芯片技術(shù)篩選ZIC1調(diào)控的與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的下游基因并進行驗證，研究其可能的轉(zhuǎn)移分子機制，為尋找胃癌轉(zhuǎn)移新分子治療靶標(biāo)提供重要實驗依據(jù)。
　　研究方法：
　　1、ZIC1對裸鼠皮下胃癌移植瘤形成的影響
　?、傥赴┘?xì)胞SGC7901穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pFlag-CMV4 Vector和pFlag-CMV4-ZIC1質(zhì)粒。
　　

4、②構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型，驗證過表達(dá)ZIC1對胃癌移植瘤生長及形成的影響。
　　2、ZIC1在裸鼠胃癌肺轉(zhuǎn)移和腹腔種植轉(zhuǎn)移中的作用
　?、儆胠entivirus-GFP Vector和lentivirus-GFP ZIC1感染胃癌細(xì)胞BGC823，構(gòu)建ZIC1過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。
　?、诼闶笪察o脈注射穩(wěn)轉(zhuǎn)的BGC-Vector和BGC-ZIC1細(xì)胞株，構(gòu)建血行轉(zhuǎn)移模型，觀察過表達(dá)ZIC1對胃癌肺轉(zhuǎn)移的影響及對裸鼠生存周期

5、的影響。
　?、勐闶蟾骨蛔⑸浞€(wěn)轉(zhuǎn)的BGC-Vector和BGC-ZIC1細(xì)胞株，構(gòu)建腹腔種植轉(zhuǎn)移模型，觀察過表達(dá)ZIC1對胃癌腹腔種植轉(zhuǎn)移的影響。
　　3、ZIC1調(diào)控靶基因及轉(zhuǎn)移相關(guān)信號通路的研究
　?、俜謩e提取穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞BGC-Vector和BGC-ZIC1的RNA，利用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)檢測篩選出下游差異表達(dá)的基因，以表達(dá)升高或降低3倍以上作為有生物學(xué)統(tǒng)計意義，并對其中7個與侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)的候選基因進行Q-PCR驗證

6、。
　?、赒-PCR檢測胃癌細(xì)胞BGC823穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ZIC1后EPB41L3基因的表達(dá)水平。
　?、跶-PCR檢測不同胃癌細(xì)胞株和胃上皮正常細(xì)胞GES-1中EPB41L3基因的表達(dá)水平。
　　研究結(jié)果：
　　1、過表達(dá)ZIC1對裸鼠皮下胃癌移植瘤的形成無明顯影響。
　?、俳?jīng)G418篩選后得到穩(wěn)轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞株SGC-Vector和SGC-ZIC1。
　?、诼闶笪赴┢は乱浦擦鰧嶒灠l(fā)現(xiàn)過表達(dá)ZIC1對胃癌的形

7、成無顯著影響。
　　2、過表達(dá)ZIC1可以顯著抑制胃癌細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移和腹腔種植轉(zhuǎn)移。
　?、俳?jīng)慢病毒感染及嘌呤霉素篩選后，獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株BGC-Vector和BGC-ZIC1。
　　②裸鼠胃癌血行轉(zhuǎn)移模型發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ZIC1可顯著抑制胃癌肺轉(zhuǎn)移，延長裸鼠的生存周期(p＜0.05)。
　?、勐闶笪赴└骨环N植轉(zhuǎn)移模型發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ZIC1可顯著抑制胃癌的腹腔種植轉(zhuǎn)移(p＜0.05)。
　　3、篩選和驗證ZIC1調(diào)控與腫

8、瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的下游基因。
　?、偻ㄟ^人類全基因組芯片篩選出ZIC1上調(diào)基因289個，下調(diào)基因304個，功能歸類分析顯示差異基因主要參與細(xì)胞周期、細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等。挑選其中與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的7個基因進行Q-PCR驗證，結(jié)果與芯片檢測結(jié)果基本相符。其中以EPB41L3的上調(diào)改變最為顯著。
　?、赗T-PCR發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞BGC823過表達(dá)ZIC1后EPB41L3基因顯著升高。
　?、跶-PC