穿心蓮內(nèi)酯抑制胃癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移的作用研究及分子機制初探.pdf

1、目的:
　　研究不同濃度的穿心蓮內(nèi)酯對人胃癌細胞體外抑制增殖和轉(zhuǎn)移的影響及可能的分子學(xué)機制。
　　方法:
　　實驗共設(shè)MGC803、BGC823、SGC7901三個細胞系，每一個細胞系分為0.02％DMSO空白對照組和穿心蓮內(nèi)酯不同濃度藥物處理組。采用MTT比色法檢測不同終濃度的穿心蓮內(nèi)酯對人胃癌細胞增殖的影響。采用流式細胞儀檢測不同濃度的穿心蓮內(nèi)酯對人胃癌細胞增殖和凋亡的影響。采用劃痕實驗和transwell實驗觀察

2、不同濃度穿心蓮內(nèi)酯對人胃癌細胞遷移及侵襲力的影響。采用明膠酶譜法觀察不同濃度穿心蓮內(nèi)酯對胃癌細胞MMP-2、MMP-9的影響。采用Western blot法檢測不同濃度穿心蓮內(nèi)酯對人胃癌細胞中TIMP-1、 TIMP-2、 CD147、 Bax、 Bcl-2、 CyclinB1、p-Cdc2(cdk1)蛋白陽性表達率的影響。應(yīng)用熒光實時定量多聚酶鏈反應(yīng)(Real-time quantitative reverse transcripti

3、on polymerase chain reaction, Real-time-PCR的方法檢測不同濃度穿心蓮內(nèi)酯對人胃癌細胞中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2、Bax、Bcl-2、iNOS、SurvivinmRNA表達水平的影響。
　　結(jié)果:
　　1.穿心蓮內(nèi)酯抑制MGC803、BGC823、SGC7901細胞的增殖，隨著濃度增加，胃癌細胞存活率降低，且呈存活率-時間依賴性。
　　2.流式細胞周期檢

4、測顯示穿心蓮內(nèi)酯對MGC803、BGC823、SGC7901細胞均出現(xiàn)不同程度的G2/M期阻滯，且隨著濃度的增加，G2/M期阻滯的細胞數(shù)目增多。
　　3.流式細胞凋亡檢測顯示穿心蓮內(nèi)酯能明顯誘導(dǎo)MGC803、BGC823、SGC7901細胞凋亡，隨著藥物作用濃度的升高，同胃癌細胞組細胞早期和晚期凋亡率均有不同程度增加，說明藥物誘導(dǎo)細胞凋亡效果具有明顯的濃度依賴性。
　　4.劃痕實驗顯示隨著穿心蓮內(nèi)酯濃度增加，MGC803、B

5、GC823、SGC7901細胞劃痕間隙逐漸增寬。說明穿心蓮內(nèi)酯對胃癌SGC7901細胞的遷移有抑制作用，且隨濃度增加抑制作用逐漸增強。
　　5.Transwell實驗顯示經(jīng)過不同濃度穿心蓮內(nèi)酯處理24小時的MGC803、BGC823、SGC7901細胞穿過transwell小室的數(shù)目均能得到抑制，隨著藥物濃度的提高，穿過小室的細胞數(shù)逐漸減少。
　　6.明膠酶譜實驗中發(fā)現(xiàn)MGC803細胞系MMP-2有明顯表達，MMP-9有微弱

6、表達，各藥物組與正常對照組相比，MMP-2條帶中亮度均有不同程度減弱，但組間差異不明顯。MMP-9條帶中、高劑量組與空白對照組相比表達減弱，低劑量組差異不明顯;BGC823細胞系MMP-2、MMP-9均有表達，藥物各組與空白對照組相比表達稍有減弱，但各組間差異不明顯。SGC7901細胞系MMP-2有表達，MMP-9無明顯表達，藥物各組與空白對照組相比表達減弱，但各組間差異不明顯。
　　7.Western blot法發(fā)現(xiàn)，穿心蓮內(nèi)酯

7、處理24h胃癌MGC803細胞，CD147條帶中，空白組對照組與藥物組無明顯差異。Cyclin B1、p-CDC2、TIMP-1、TIMP-2條帶中藥物組比空白對照組亮度增強，且隨濃度增加亮度增加。Bcl-2/Bax比值隨藥物濃度下降而降低;穿心蓮內(nèi)酯處理24h胃癌BGC803細胞，CD147條帶中，空白對照組與藥物組無明顯差異。Cyclin B1、TIMP-1、TIMP-2、p-CDC2條帶中藥物組比對照組亮度增強，且隨濃度增加亮度增

8、加;穿心蓮內(nèi)酯不同濃度處理胃癌SGC7901細胞24h，CD147條帶中，空白對照組與藥物組無明顯差異。Cyclin B1、TIMP-1、TIMP-2條帶中藥物組比空白對照組亮度增強，且隨濃度增加亮度增加。Bcl-2條帶中藥物組比空白對照組亮度降低，且隨濃度增加亮度逐漸降低。
　　8.實時熒光定量PCR（real-time PCR）結(jié)果顯示，穿心蓮內(nèi)酯處理MGC803、BGC823、SGC7901細胞24h，TIMP-1、TIMP

9、-2 mRNA與空白對照組相比，均呈不同程度的上升，MMP-2 mRNA與空白對照組相比呈不同程度的下降。SGC7901細胞系Bax、Bik mRNA隨著藥物濃度增高呈不同程度上升，Bcl-2、Survivin mRNA隨藥物濃度增高呈不同程度下降。
　　結(jié)論:
　　1.穿心蓮內(nèi)酯可以抑制胃癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移;
　　2.穿心蓮內(nèi)酯可以抑制胃癌細胞轉(zhuǎn)移，可能是通過上調(diào)TIMP-1、TIMP-2和下調(diào)MMP-2、MMP-9