穿心蓮內(nèi)酯衍生物ADS體外抗腫瘤作用機制研究.pdf

1、穿心蓮Andrographis paniculata(Burm.f.)Nees為我國傳統(tǒng)中草藥，具有清熱解毒，涼血消腫之功效。近年來的研究表明以穿心蓮內(nèi)酯為代表的二萜內(nèi)酯類成分具有廣譜的抗癌活性，本課題組合成了穿心蓮內(nèi)酯衍生物ADS，體內(nèi)抗腫瘤作用研究發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤活性顯著。
　　本課題擬研究ADS對小鼠乳腺癌4T-1細胞和小鼠肺癌LLC細胞的增殖抑制作用，并對其抗腫瘤分子機制進行探討。
　　課題采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法

2、檢測ADS對4T-1和LLC細胞增殖的影響，碘化丙啶(PI)染色法流式細胞儀測定ADS對細胞周期的影響，光學顯微鏡下觀察細胞凋亡的形態(tài)學變化，吖啶橙/溴乙啶(AO/EB)雙染法和PI/Hoechst33258熒光染色法高內(nèi)涵檢測ADS對細胞凋亡的影響，羅丹明123(Rh123)/Hoechst33258雙染法高內(nèi)涵檢測細胞凋亡時線粒體膜電位的變化，免疫蛋白印跡法檢測凋亡通路中相關蛋白caspases-3，caspases-9，Bcl-2

3、，Bax及細胞色素C(Cyto c)等的表達。
　　MTT法檢測結(jié)果顯示，ADS對4T-1和LLC細胞增殖均有明顯的生長抑制作用，并呈時間、劑量依賴性，與空白對照組相比有顯著性差異，對4T-1細胞的IC50值是(5.5±1.36)μM(24 h)和(4.4±0.93)μM(48 h)，對LLC細胞的IC50值是(4.12±1.27)μM(24 h)和(5.15±1.01)μM(48 h)，對于兩種細胞的抗腫瘤作用均強于穿心蓮內(nèi)酯A

4、。
　　PI染色法檢測細胞周期結(jié)果顯示，3.2μM ADS即可誘導4T-1細胞周期阻滯于G2/M期，細胞比例（22.44±0.7）％與空白對照組（7.95±0.1）％相比有非常顯著性差異;1.8μMADS可誘導LLC細胞周期阻滯于G0/G1期，細胞比例（55.44±2.7）％與空白對照組(35.52±3.9)％相比有顯著性差異，而2.5μM ADS、3.0μM ADS誘導LLC細胞周期阻滯于G2/M期，細胞比例分別為（14.4±0

5、.8）％、（16.13±1.6）％與空白對照組（6.41±0.6）％相比均有顯著性差異。
　　光學顯微鏡下觀察結(jié)果顯示，2μM左右ADS作用24 h后，4T-1和LLC細胞呈現(xiàn)細胞凋亡的形態(tài)學特征，如細胞皺縮變圓、碎裂、形成“凋亡小體”等。
　　AO/EB和PI/Hoechst33258免疫熒光染色后結(jié)果顯示，空白對照組細胞核成正常形態(tài)，ADS處理組染色質(zhì)固縮，細胞核呈致密濃染或呈致密濃染的碎塊狀，并呈現(xiàn)劑量依賴性。

6、　　采用Rh123/Hoechst33342雙染法對線粒體膜電位進行檢測，高內(nèi)涵檢測結(jié)果顯示，ADS作用可導致4T-1和LLC細胞線粒體膜電位發(fā)生降低，并呈現(xiàn)劑量依賴性。
　　免疫蛋白印跡法檢測結(jié)果表明，ADS作用引起了caspases家族的活化，caspases-3，caspases-9與細胞色素C的表達增多，Bcl-2家族也參與了凋亡的過程，Bcl-2表達減少，Bax表達增多。
　　本課題研究發(fā)現(xiàn)ADS對4T-1和LLC