穿心蓮內(nèi)酯衍生物ADA誘導(dǎo)人乳腺癌和肺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、肺癌已成為中國(guó)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，而乳腺癌是女性惡性腫瘤發(fā)病率的首位。過(guò)去研究者把重點(diǎn)放在細(xì)胞分化與分裂方面，并沒(méi)有重視細(xì)胞死亡與腫瘤發(fā)生的關(guān)聯(lián)?，F(xiàn)有研究表明細(xì)胞增殖過(guò)度是因?yàn)榧?xì)胞自身清除能力下降，即本應(yīng)該發(fā)生凋亡的細(xì)胞并未發(fā)生凋亡。
　　穿心蓮為爵床科（Acanthaceae）植物穿心蓮（Andrographis paniculata（Bum.f.）Nees）的干燥地上部分，具有清熱解毒、涼血消腫之功效，在亞洲有廣泛的應(yīng)用，享

2、有“苦味之王”的稱(chēng)號(hào)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，以穿心蓮內(nèi)酯為代表的二萜內(nèi)酯類(lèi)成分具有廣譜的抗腫瘤作用。本文研究了穿心蓮內(nèi)酯衍生物ADA對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞和人肺A549細(xì)胞的增殖抑制作用，并通過(guò)對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響探討其作用機(jī)制。采用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞增殖。DAPI、吖啶橙/溴乙啶（AO/EB）雙染法以及Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡。羅丹明123檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位變化。Western bo

3、lt法檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白NF-κB p65核位移、IκBɑ、磷酸化IκBɑ、磷酸化IKKβ的表達(dá)以及凋亡通路中相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、細(xì)胞色素C和caspase3的表達(dá)。
　　MTT結(jié)果顯示，不同濃度ADA和穿心蓮內(nèi)酯A作用24h后，均能抑制MCF-7和A549細(xì)胞增殖。ADA對(duì)A549細(xì)胞IC50為（9.65±1.50）μM，對(duì)MCF-7細(xì)胞IC50為（6.4±3.29）μM。A對(duì)A549細(xì)胞IC50為(25.4

4、9±4.02)μM，對(duì)MCF-7細(xì)胞IC50為(19.5±2.82)μM，此數(shù)據(jù)表明ADA對(duì)于兩種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用顯著優(yōu)于先導(dǎo)化合物A，表明ADA比其母體A具有更強(qiáng)的抗乳腺癌和抗肺癌活性。
　　DAPI、AO/EB染色結(jié)果表明：與空白對(duì)照組相比ADA加藥組細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯變化如細(xì)胞核缺失，染色質(zhì)固縮，細(xì)胞邊緣化等細(xì)胞凋亡特征。AO/EB染色圖顯示，ADA加藥組與空白對(duì)照組細(xì)胞相比細(xì)胞核發(fā)出橘色熒光，EB的熒光強(qiáng)度隨著給藥濃度

5、的增加顯著增強(qiáng)(P＜0.01)，表明細(xì)胞出現(xiàn)凋亡形態(tài)特征。
　　羅丹明123（Rh123）結(jié)果表明：經(jīng)過(guò)ADA作用24h后，Rh123熒光隨著藥物濃度的增加顯著降低（P＜0.01），表明MCF-7和A549細(xì)胞線粒體膜電位降低，膜電位降低被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡發(fā)生的標(biāo)志。表明腫瘤細(xì)胞因?yàn)榘l(fā)生凋亡而失去與羅丹明123結(jié)合的能力。
　　流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明：當(dāng)ADA濃度為4μM、8.5μM、10μM時(shí)，A549細(xì)胞凋亡率分別為為6.41

6、％±2.51，9.28％±1.86，21.85％±7.75，32.46％±7.61；當(dāng)ADA濃度為2μM、4μM、6μM時(shí)，MCF-7細(xì)胞凋亡率為4.34％±1.12，21.22％±2.09，32.46％±7.61，19.06％±1.23。ADA作用24h后腫瘤細(xì)胞凋亡率均顯著增加(P＜0.01)，表明ADA能夠誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7與肺癌細(xì)胞A549凋亡。
　　Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：MCF-7和A549細(xì)胞細(xì)

7、胞色素C被刺激釋放，caspase3被激活且表達(dá)增加(P＜0.01)；促凋亡蛋白Bax的表達(dá)增加（P＜0.01），抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)降低（P＜0.05），提示ADA參與細(xì)胞色素C、Bax、Bcl-2、caspase3的調(diào)控，同時(shí)磷酸化IκBɑ、磷酸化IKKβ、細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65表達(dá)均降低（P＜0.01)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)p65表達(dá)增加(P＜0.01)，表明ADA也參與NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控。
　　綜上所述，穿心蓮內(nèi)酯衍生