穿心蓮內酯對GSIs抵抗型T-ALL的干預及機制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  急性T淋巴細胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia,T-ALL)是一種惡性血液系統(tǒng)腫瘤,以不成熟的T淋巴細胞母細胞惡性增殖為特點。臨床以聯(lián)合化療為主,但出現(xiàn)復發(fā)和化療抵抗的幾率較高。而復發(fā)和化療抵抗的病例預后往往較差。近年來,γ-分泌酶抑制劑(γ-secretase inhibitors,GSIs)對T-ALL的治療作用備受關注。緣于GSIs是一類可以抑制NOTCH1激活的小分

2、子化合物,而大量的研究顯示NOTCH1通路的異?;罨赥-ALL中扮演重要角色。但到目前為止GSIs的臨床實驗卻沒有取得突破。原因在于GSIs出現(xiàn)了臨床治療抵抗并且伴有劑量依賴性的胃腸道毒性反應。
  本研究以中藥穿心蓮的主要活性成分穿心蓮內酯(Andrographolide)為研究對象。體外選擇GSIs抵抗的T-ALL細胞系,探究穿心蓮內酯克服GSIs抵抗和恢復GSIs敏感性的作用及機制。并觀察穿心蓮內酯對健康人外周血淋巴細胞的

3、作用,明確穿心蓮內酯的安全性和選擇性。構建GSIs抵抗的T-ALL動物模型,證實穿心蓮內酯體內克服GSIs抵抗和恢復GSIs敏感性的作用。同時觀察穿心蓮內酯與GSIs合用對GSIs胃腸道毒性的緩解作用。
  方法:
  穿心蓮內酯體外克服GSIs抵抗及對健康人外周血淋巴細胞的影響。MTS法觀察穿心蓮內酯及其衍生物對CRFF-CEM和Jurkat細胞增殖活力的影響,并計算EC50值。穿心蓮內酯單用及與DAPT(GSI-IX)合

4、用干預CRFF-CEM和Jurkat細胞。DAPT是一種新型的GSIs,同樣具有抑制NOTCH1活化的作用。MTS法檢測細胞增殖活力,細胞計數(shù)記錄細胞增殖曲線。Annexin-Ⅴ/PI雙染法檢測細胞凋亡。PI染色檢測細胞周期的變化。分離健康人外周血淋巴細胞,以2,4,8,16μM的穿心蓮內酯干預,測定細胞增殖活力和細胞凋亡情況。
  穿心蓮內酯對引起GSIs抵抗的關鍵蛋白及通路的調控作用。穿心蓮內酯單用或與DAPT合用干預CRFF

5、-CEM和Jurkat細胞。蛋白免疫印跡檢測經NOTCH1胞內活化形式NICD以及PI3K/Akt/S6通路中的關鍵蛋白pAkt和pS6的表達。蛋白免疫印跡檢測CRFF-CEM和Jurkat細胞中c-Myc和Mcl-1的蛋白表達,qRT-PCR相對定量c-Myc和Mcl-1的mRNA表達。蛋白免疫印跡測定穿心蓮內酯對CRFF-CEM和Jurkat細胞NF-κB通路中的p105/p50,p65,IKKβ和IκBα蛋白表達的調控。
 

6、 穿心蓮內酯恢復GSIs敏感性的關鍵位點。檢測c-Myc抑制劑10058-F4單用及與DAPT合用對CRFF-CEM和Jurkat細胞增殖活力和凋亡的影響。檢測PI3K抑制劑PI-103單用及與DAPT合用抑制CRFF-CEM和Jurkat細胞增殖和誘導凋亡的作用。檢測10058-F4,PI-103,DAPT三者合用對NICD,c-myc,p-Akt和pS6表達的影響。觀察10058-F4,PI-103,DAPT三者合用對CRFF-CE

7、M和Jurkat細胞增殖活力及凋亡的影響。MCL1的shRNA克隆慢病毒侵染Jurkat細胞,沉默Mcl-1的轉錄激活和表達。檢測DAPT對Mcl-1沉默的Jurkat細胞的增殖活力和凋亡作用的影響。
  穿心蓮內酯體內克服GSIs抵抗及緩解GSIs的胃腸道毒性。BAlB/c裸鼠皮下注射Jurkat細胞懸液構建GSIs抵抗的T-ALL人癌異體移植瘤模型。穿心蓮內酯200mg/kg,DAPT25mg/kg,及兩者合用灌胃干預荷瘤BA

8、lB/c裸鼠20天,記錄腫瘤體積變化并計算腫瘤抑制率。免疫組化檢測腫瘤組織中Ki-67和Caspase-3表達變化。蛋白免疫印跡檢測腫瘤組織中NICD,pAkt,p65,c-Myc,pS6及Mcl-1的蛋白表達。25mg/kgDAPT,100mg/kg DAPT,200mg/kg穿心蓮內酯,200mg/kg穿心蓮內酯+25mg/kg DAPT灌胃干預C57BL/6小鼠7天。取C57BL/6小鼠十二指腸,HE染色觀察腸道上皮杯狀細胞病理變

9、化。
  結果:
  穿心蓮內酯對CRFF-CEM和Jurkat均表現(xiàn)出較強的抑制細胞增殖的作用,EC50分別為2.604μM和3.782μM。而內酯環(huán)脫去-OH的穿心蓮內酯的衍生物則對細胞活力沒有明顯影響。DAPT對CRFF-CEM和Jurkat的細胞活力,凋亡及周期均沒有明顯影響。穿心蓮內酯對DAPT抵抗的CRFF-CEM和Jurkat的細胞具有抑制細胞增殖活力,誘導細胞凋亡和阻滯細胞周期的作用。而與DAPT合用后抑制增

10、殖,誘導凋亡和阻滯周期的作用增強。穿心蓮內酯不引起明顯的健康人外周血淋巴細胞的凋亡,且具有一定的促進增殖的作用。
  穿心蓮內酯對NICD也具有一定的抑制作用。而且可以下調超活化的PI3K/Akt通路中關鍵蛋白pAkt和pS6的表達。穿心蓮內酯下調FBXW7突變所致的c-Myc和Mcl-1過表達,同時抑制MYC和MCL1的轉錄激活。穿心蓮內酯還能夠重新激活DAPT對c-Myc的抑制作用。穿心蓮內酯抑制NF-κB通路的激活。相對p1

11、05/p50,主要下調p65的表達。還能夠抑制上游激活型號IKKβ的表達,但是卻沒有提高掩蓋NF-κB的核定位信號的IκBα的表達。
  c-Myc抑制劑10058-F4和PI3K抑制劑PI-103均可以抑制CRFF-CEM和Jurkat細胞的增殖。但是并沒有恢復DAPT抑制細胞增殖和誘導凋亡作用。10058-F4,PI-103和DAPT三者合用對PI3K/Akt/S6通路,c-Myc和NICD均具有較強的抑制作用。10058-F

12、4和PI-103兩者合用相較各自單用抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡作用更強。但是10058-F4,PI-103和DAPT三者合用恢復DAPT抑制細胞增殖和誘導凋亡的作用仍然有限。DAPT對MCL1被沉默的Jurkat細胞表現(xiàn)出一定的抑制增殖和誘導凋亡作用。
  穿心蓮內酯抑制了BAlB/c裸鼠的Jurkat細胞皮下移植瘤的生長。DAPT沒有表現(xiàn)出抑制腫瘤生長的作用。但是穿心蓮內酯和DAPT合用后抑制腫瘤生長的作用更明顯。穿心蓮內酯抑制

13、腫瘤組織中反應細胞增殖活躍程度的Ki-67的表達而增強凋亡蛋白Caspase-3的表達。穿心蓮內酯和DAPT聯(lián)合干預對Ki-67的抑制作用和Caspase-3的上調作用更強。DAPT體內依然具有對NICD較強的抑制作用。穿心蓮內酯和DAPT合用在體內也保持了對NICD,pAkt,p65,c-Myc,pS6和Mcl-1的表達的抑制作用,與體外細胞實驗的結果一致。100mg/kg DAPT灌胃7天引起C57BL/6小鼠十二指腸上皮細胞出現(xiàn)明

14、顯杯狀細胞化生。而降低劑量以25mg/kg的DAPT灌胃C57BL/6小鼠7天,小鼠十二指腸未出現(xiàn)明顯的病理變化。同樣,200mg/kg穿心蓮內酯和25mg/kgDAPT聯(lián)用也沒有引起C57BL/6小鼠十二指腸的明顯病理改變。
  結論:
  穿心蓮內酯抑制GSIs抵抗的細胞增殖,誘導凋亡,阻滯分裂周期。并且能夠一定程度恢復DAPT的敏感性。內酯環(huán)上的-OH對穿心蓮內酯活性的保持非常重要。穿心蓮內酯不引起健康人外周血淋巴細胞

15、的凋亡,還具有一定的刺激增殖作用。
  穿心蓮內酯本身也具有一定的抑制NOTCH1胞內活化的作用。而其對GSIs抵抗的細胞依然保持較強的抑制作用可能與以下機制有關。(1)下調PTEN缺失或失活引起的PI3K/Akt通路超活化。(2)抑制FBXW7突變導致的c-Myc過表達,并能夠重新激活DAPT對c-Myc的抑制作用。(3)阻滯由FBXW7突變繼發(fā)的Mcl-1過表達而引起的凋亡逃逸。(4)抑制NF-κB通路的激活。
  單純

16、抑制c-Myc和PI3K/Akt通路并不能恢復DAPT的敏感性。同時抑制c-Myc和PI3K/Akt通路對DAPT敏感性的恢復作用也有限。而抑制MCL1的轉錄激活和表達可能是恢復GSIs敏感性的關鍵。
  穿心蓮內酯體內依然具有抗T-ALL的活性,并且能夠恢復DAPT在體內的活性。穿心蓮內酯抑制腫瘤細胞在體內的增殖并誘導凋亡,對與T-ALL發(fā)病密切相關的蛋白的作用與體外細胞實驗結果一致。穿心蓮內酯和低劑量的DAPT合用能夠緩解DA

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