MACC1基因沉默對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制探討.pdf

1、研究背景：
　　上皮性卵巢癌是婦女最常見的惡性腫瘤之一，為引起婦女死亡的第五大腫瘤，全球發(fā)病率逐年增加，且有年輕化的趨勢(shì)。由于卵巢癌起病隱匿，缺乏早期篩查手段，大部分患者初診即為晚期，錯(cuò)過了手術(shù)治療的機(jī)會(huì)。雖然早期卵巢癌患者5年生存率為70％~90%，但其診斷率卻只20%左右，況且術(shù)后極易復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，術(shù)后轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)仍是臨床上管理患者所遇到的最大挑戰(zhàn)。因此，卵巢癌的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)是臨床醫(yī)生和科研工作者普遍重視的問題，為研究的熱點(diǎn)。

2、>　　越來越多的研究證明，腫瘤細(xì)胞內(nèi)某些基因活性的改變?cè)谀[瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等病理過程中發(fā)揮著重要作用，其中腫瘤轉(zhuǎn)移基因和腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因引起學(xué)者的廣泛關(guān)注和研究。MACC1作為在結(jié)腸癌中新發(fā)現(xiàn)的促腫瘤轉(zhuǎn)移基因，在體外研究中可明顯增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的化學(xué)趨向性和侵襲性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移蠕動(dòng)功能；在臨床研究中發(fā)現(xiàn) MACC1高表達(dá)結(jié)腸癌患者的生存期明顯縮短，低表達(dá)者的5年生存率為80%，而高表達(dá)者僅為15%。作為癌基因 C-MET的關(guān)鍵

3、調(diào)節(jié)因子之一，MACC1可能通過 HGF/C-MET信號(hào)通路來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)將研究 MACC1對(duì)卵巢癌惡性行為的影響和相關(guān)機(jī)制，為抑制卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移提供新的靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　研究目的：
　　利用小分子 RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建 MACC1基因瞬時(shí)沉默的人卵巢癌細(xì)胞株模型，觀察卵巢癌細(xì)胞體外增殖、黏附、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管形成的變化及可能機(jī)制。
　　研究方法：
　　1.高表達(dá) MACC1基因的卵巢癌細(xì)

4、胞株的篩選
　　應(yīng)用 RT-qPCR及 Western blot方法檢測(cè)4株不同轉(zhuǎn)移潛能的卵巢癌細(xì)胞株：OVCAR3、ES-2、SKOV-3、HO-8910中 MACC1 mRNA及蛋白的表達(dá)情況。
　　2. siRNA的篩選及細(xì)胞轉(zhuǎn)染
　　針對(duì) MACC1基因設(shè)計(jì)并合成靶向 siRNAs,轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞 OVCAR3，沉默MACC1基因，利用 RT-qPCR及 Western blot技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染 siRNA后 MA

5、CC1表達(dá)水平的變化，篩選出一條干擾效率最高的 siRNA，將此用于后續(xù)研究。
　　3.沉默 MACC1基因?qū)β殉舶┘?xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響
　　采用 CCK8檢測(cè)細(xì)胞的體外增殖能力，采用黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞黏附能力，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的體外侵襲能力，Transwell遷移實(shí)驗(yàn)及劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力，采用血管擬態(tài)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的體外血管形成能力。
　　4. MACC1影響卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究
　

6、　采用 Western blot方法檢測(cè) C-MET蛋白表達(dá)的變化，構(gòu)建 C-MET啟動(dòng)子核心區(qū)域的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒 pGL3-C-MET，探討 MACC1沉默后其活性的變化，從而研究腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)理。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　應(yīng)用 SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以X±s表示，比較采用 t檢驗(yàn)和方差分析，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.成功篩選出 MACC

7、1基因高表達(dá)的人卵巢癌細(xì)胞株：OVCAR3。
　　2. siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，MACC1基因表達(dá)受到不同程度的抑制，其沉默效率最高達(dá)75.73%。與陰性對(duì)照組相比，干擾組轉(zhuǎn)染 MACC1-siRNA后24 h、48 h、72 h MACC1 mRNA分別下降了59.91%，75.45%，70.64%，蛋白表達(dá)水平分別下降60.22%,63.75%,54.94%。
　　3. MACC1-siRNA轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞后，體外增殖、黏

8、附、侵襲、遷移和血管形成能力均較對(duì)照組減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　4. MACC1-siRNA轉(zhuǎn)染人卵巢癌細(xì)胞 OVCAR3后，熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：其下游靶基因 C-MET啟動(dòng)子活性明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Western blot結(jié)果顯示：C-MET蛋白在干擾組表達(dá)下調(diào)，抑制率為41.5%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.抑制 MACC1基因的表