bmo-miR-1對家蠶幼蟲蛻皮的調(diào)控.pdf

1、MicroRNA(miRNA)是一類大小約為22nt左右的小RNA分子，它們通過RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄，并經(jīng)過Drosha和Dicer酶切割形成成熟體，通過轉(zhuǎn)錄后抑制靶基因的表達來實現(xiàn)其調(diào)控作用。迄今為止，已有20000多條miRNA被發(fā)現(xiàn)，它們廣泛涉及到生物體幾乎所有的生理活動中。近年來，家蠶miRNA的研究也正在逐步開展，多國科學家共鑒定了562個家蠶成熟體miRNA，并通過微陣列芯片、深度測序等技術(shù)對家蠶miRNA的時空表達情況進行了

2、調(diào)查，這就為進一步的功能研究奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　 MiR-l是一種進化上較為保守的miRNA，其他物種中的相關(guān)研究表明，miR-l主要參與肌組織的發(fā)育和增殖分化、離子通道的調(diào)控、腫瘤的抑制以及病毒的復(fù)制等生理過程。家蠶中也存在有miR-l，其成熟體序列長度為22nt，主要在頭、體壁等組織中表達。那么在家蠶中，miR-l究竟有什么樣的生物學功能?它的靶基因有哪些?為了回答這兩個問題，我們設(shè)計了以下的研究方案：通過miR-l模擬

3、物上調(diào)家蠶體內(nèi)miR-l的水平，觀察可能出現(xiàn)的異常表型；通過基因芯片技術(shù)調(diào)查注射miR-l模擬物的家蠶基因的差異表達；預(yù)測家蠶miR-l的靶基因，結(jié)合芯片數(shù)據(jù)尋找可能的靶基因；通過mRNA水平和蛋白水平檢測，以及雙熒光素酶報告系統(tǒng)來驗證miR-l的靶基因。通過該方案，獲得的主要研究結(jié)果如下：
　　 (1)上調(diào)Bmo-miR-l導致家蠶蛻皮障礙
　　 家蠶幼蟲吐完絲后身體縮短成為預(yù)蛹，經(jīng)過2到3天蛹皮形成并蛻皮形成蛹。在預(yù)

4、蛹期注射miR-l模擬物的家蠶不能蛻去舊表皮，透過半透明的的舊表皮可以看到內(nèi)部蛹內(nèi)表皮的形成受到的影響不是很大。剝開舊表皮可以發(fā)現(xiàn)內(nèi)部是一個變形的蛹，由于頭胸部舊表皮束縛的原因在蛹頭胸部有一明顯的縊痕，并且翅殘缺不全。新舊表皮間有少量液體存在，液體中可能含有多種酶類，可以造成蛹表皮的損壞。人工剝開外表皮的蛹仍可以存活若干天，但在化蛾前死亡。推測可能是由于蛹表皮不完整導致水分喪失過快而造成。
　　 (2)Bmo-miR-l mim

5、ics引起大量基因差異表達
　　 家蠶蛻皮是由多個生化和生理過程組成，必然要涉及到成百上千基因的協(xié)同作用。微陣列芯片檢測發(fā)現(xiàn)，共有1450個基因被檢測到差異表達，包括814個上調(diào)基因和636個下調(diào)基因。GO分類結(jié)果表明，其中有614個基因具有1條以上的GO注釋，總共涉及到19個GO二級分類，細胞過程、生理過程、催化活性和代謝為4個最為富集的GO類目，說明大量涉及到基礎(chǔ)代謝和生理過程的基因受到影響。進一步分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)分子活性、免

6、疫系統(tǒng)進程、胞外區(qū)域等類目下差異基因較為富集，而生長、遷移類目下只有下調(diào)基因，說明家蠶的生長和表皮結(jié)構(gòu)的形成維持受到了影響。同時，表皮的受損導致體表屏障出現(xiàn)缺陷，從而誘發(fā)免疫系統(tǒng)的激活。對255個表皮蛋白的差異表達分析發(fā)現(xiàn)，有132個表皮蛋白檢測到有表達，其中與幾丁質(zhì)結(jié)合有關(guān)的RR-1和RR-2家族分別有85％和75％的成員下調(diào)表達，而與幾丁質(zhì)無關(guān)的CPG、Tweedle和CPFL家族均無明顯下調(diào)。CPH家族結(jié)構(gòu)和功能較為多樣，其家族成

7、員上下調(diào)基因數(shù)目也較為接近。由此可以猜測蛻皮異常表型產(chǎn)生的原因可能部分歸結(jié)為表皮蛋白基因表達模式的改變所導致的幾丁質(zhì)-表皮蛋白相互作用的異常。
　　 (3)下調(diào)基因中包括部分預(yù)測的bmo-miR-l靶基因
　　 靶基因的預(yù)測是miRNA功能研究必不可少的環(huán)節(jié)。通過對已有的家蠶3’UTR數(shù)據(jù)庫進行預(yù)測，得到87個潛在bmo-miR-l靶基因，很多靶基因在家蠶和其他物種間存在保守性，比如vATPase家族兩個成員(BmATP

8、6v0c1和BmATP6v0d1)和膠轉(zhuǎn)蛋白TAGLN。結(jié)合基因差異表達數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)有18個潛在的靶基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)。其中就包括上述3個保守的bmo-miR-l靶基因。發(fā)現(xiàn)家蠶幾丁質(zhì)酶基因BmChi既是bmo-miR-l潛在的靶基因又有5倍左右的下調(diào)，我們推測該基因可能受到bmo-miR-l的抑制。
　　 (4)家蠶幾丁質(zhì)酶基因BmChi是bmo-miR-l的靶基因
　　 為了進一步研究BmChi和家蠶miR-l的關(guān)系

9、，我們原核表達了BmCHI，純化并制備多克隆抗體。芯片數(shù)據(jù)、半定量RT-PCR和western blot從mRNA和蛋白水平上都證實了注射bmo-miR-l的家蠶中BmChi的表達受到明顯抑制。我們又構(gòu)建了雙熒光素酶報告載體，檢測并發(fā)現(xiàn)bmo-miR-l可以通過BmChi3’UTR來影響報告基因的表達。在潛在的靶位點中，位于356位的靶位點1對miRNA介導的抑制作用貢獻較小。這幾方面的證據(jù)共同說明了BmChi是bmo-miR-l的靶基

10、因。
　　 (5)BmChi在家蠶蛻皮過程起重要作用
　　 通過多個昆蟲之間的同源比對和系統(tǒng)進化分析，我們預(yù)測了八個家蠶GH18家族幾丁質(zhì)酶基因，分別為BmChi、BmChiR1、BmCHT2、BmCHT6、BmCHT6b、BmCHT11、BmIDGF和BmCHT12，在編碼蛋白的結(jié)構(gòu)上每個基因都有其特點。根據(jù)其他物種中同源基因功能推測，這些基因可能和家蠶的蛻皮、羽化、圍食膜的降解等有關(guān)。BmChi的時期表達譜顯示，Bm