Bm Antp基因?qū)倚Q翅發(fā)育調(diào)控的安步研究.pdf

1、翅作為動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中進(jìn)化出的新器官，對(duì)于動(dòng)物從水生到陸生，從低空到高空的跨越具有非常重要的意義。昆蟲(chóng)是最先擁有翅的無(wú)脊椎動(dòng)物，翅的獲得是昆蟲(chóng)迅速成為地球上種類最多分布最廣的生物類群的主要原因。
　　家蠶是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，也是鱗翅目昆蟲(chóng)的重要模式。研究家蠶翅突變的形成機(jī)制，不僅可以豐富昆蟲(chóng)翅發(fā)育調(diào)控理論，也可為鱗翅目害蟲(chóng)防控提供新的理論支撐。已有研究表明，昆蟲(chóng)翅的發(fā)生與Hox基因的表達(dá)密切相關(guān)。翅被限定于第2和第3胸節(jié)，這是因?yàn)镠o

2、x基因的精確表達(dá)誘導(dǎo)翅在特定的位置發(fā)生，同時(shí)抑制了翅在其它環(huán)節(jié)的生長(zhǎng)。如Scr抑制了第1胸節(jié)翅原基細(xì)胞的發(fā)育，Ubx和abd-A抑制了腹部區(qū)域翅的發(fā)育。Ubx基因只在后翅表達(dá)，它的作用在于調(diào)節(jié)不同的下游靶基因，從而導(dǎo)致前后翅形態(tài)特征的差異。Hox基因Antp在胸部表達(dá)，而在果蠅和赤擬谷盜中干涉Antp基因?qū)Τ岬男螒B(tài)并沒(méi)有影響，表明該基因并不是果蠅和赤擬谷盜翅發(fā)育所必需的。在西南大學(xué)家蠶庫(kù)保存的翅突變體中，Nc、Wes和EM都表現(xiàn)為純合體

3、胚胎致死，胸足發(fā)育異常，雜合體表現(xiàn)為成蟲(chóng)翅變小且為畸形。此前研究已表明Nc、Wes均是由于BmAntp基因突變所致，這表明BmAntp基因的異常表達(dá)能調(diào)控家蠶翅的發(fā)育，影響翅的形態(tài)。我們從這3個(gè)材料出發(fā)，研究BmAntp基因在家蠶翅發(fā)育中的表達(dá)模式特征，初步鑒定BmAntp基因在翅發(fā)育中的功能。取得的主要研究結(jié)果如下:
　　1.突變雜合體與野生型翅的表型差異
　　我們解剖突變雜合體和野生型不同發(fā)育時(shí)期的翅原基、蛹翅和蛾翅，對(duì)

4、它們的表型特征進(jìn)行觀察比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變體與野生型在上蔟前翅原基大小形態(tài)無(wú)明顯差異，而上蔟后第2天隨著翅原基展開(kāi)，可觀察到突變體翅原基無(wú)法正常伸展，出現(xiàn)皺縮、折疊、卷曲現(xiàn)象，化蛹后蛹翅殘缺短小覆蓋不全，成蟲(chóng)表現(xiàn)為畸形小翅。
　　2.BmAntp在家蠶翅發(fā)育中的表達(dá)模式
　　為了更好地了解BmAntp基因在家蠶翅發(fā)育中的功能，我們調(diào)查了BmAntp基因在家蠶前后翅中的表達(dá)模式。以野生型大造五齡1天至化蛾前后翅原基cDNA為材

5、料，通過(guò)定量PCR檢測(cè)BmAntp基因在家蠶前后翅的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BmAntp在大造前后翅均有表達(dá)且變化趨勢(shì)基本一致，在上蔟前表達(dá)量維持在一個(gè)較低水平，而化蛹后該基因表達(dá)明顯上升，一直持續(xù)到羽化前一天達(dá)到最高峰，之后表達(dá)下降。由此可以看出BmAntp在家蠶前后翅都有持續(xù)一致的表達(dá)，表達(dá)水平與翅的變態(tài)發(fā)育具有對(duì)應(yīng)性，暗示對(duì)翅的發(fā)育有重要調(diào)控作用。
　　3.突變體和野生型中BmAntp基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)分析
　　通過(guò)對(duì)EM突

6、變純合體和野生型大造胚胎cDNA進(jìn)行Antp序列分析，發(fā)現(xiàn)EM突變純合體中BmAntp基因Type1轉(zhuǎn)錄本3'UTR區(qū)存在異常。進(jìn)一步對(duì)基因3UTR區(qū)進(jìn)行RACE分析，發(fā)現(xiàn)在大造胚胎中擴(kuò)增得到了兩種新的轉(zhuǎn)錄本Type2、Type3，突變體中只擴(kuò)增出一種Type3。從五齡至羽化選取幾個(gè)關(guān)鍵時(shí)期對(duì)Wes、Nc和EM雜合體和野生型翅原基中BmAntp的表達(dá)水平進(jìn)行定量PCR分析，發(fā)現(xiàn)雜合體中BmAntp基因表達(dá)升高。為了進(jìn)一步鑒定轉(zhuǎn)錄水平高表

7、達(dá)是由BmAntp的正常還是異常轉(zhuǎn)錄本導(dǎo)致，我們通過(guò)Westemblot進(jìn)行蛋白水平上的表達(dá)分析，結(jié)果顯示，在突變雜合體中Antp蛋白表達(dá)降低。說(shuō)明Wes、Nc和EM雜合體中翅的突變表型可能是由于BmAntp蛋白的功能缺失引起的。
　　4.BmAntp基因?qū)倚Q翅發(fā)育調(diào)控的機(jī)制初探
　　我們選取了三個(gè)突變中翅突變表型最為明顯的Wes突變體和野生型，在上蔟48h對(duì)翅發(fā)育通路中關(guān)鍵基因如ap、vg、en等進(jìn)行熒光定量分析，發(fā)現(xiàn)在

8、雜合體中這些基因表達(dá)量均降低。為了探究BmAntp對(duì)這些基因的調(diào)控關(guān)系，我們對(duì)這些基因上游進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合預(yù)測(cè)分析，選取結(jié)合預(yù)測(cè)值較高的上游關(guān)鍵基因ap和vg，通過(guò)EMSA探究Antp蛋白與這兩個(gè)基因的作用關(guān)系。結(jié)果顯示，BmAntp作為轉(zhuǎn)錄因子，可與ap和vg直接結(jié)合，改變基因的表達(dá)，從而影響翅的發(fā)育。同時(shí)我們選取蛹5天Wes雜合體和野生型大造的前后翅分別進(jìn)行芯片分析，結(jié)果顯示，在Wes雜合體前翅中共篩查到24個(gè)上調(diào)表達(dá)的基因和14個(gè)