家蠶胚胎發(fā)育時期無翅基因Wnt1的功能分析.pdf

1、Wnt信號通路在動物胚胎發(fā)育、平面細胞極化、著色模型等生理過程中起著重要的調(diào)控作用。在模式生物果蠅的胚胎發(fā)育過程中，Wnt信號通路控制體節(jié)的形成、附肢的發(fā)育、色素沉積以及翅膀等器官的發(fā)育。家蠶是一種重要的經(jīng)濟益蟲和鱗翅目的模式昆蟲。因此，家蠶Wnt信號通路的研究有助于了解其在家蠶胚胎發(fā)育、色素沉積等生長發(fā)育過程中所起到的生理功能。成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列和相關(guān)Cas蛋白的DNA核酸內(nèi)切酶系統(tǒng)(CRISPR/Cas)是一種新興的基因

2、組編輯技術(shù)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組編輯已經(jīng)在幾種昆蟲中得到驗證。這些成功的案例主要集中在果蠅和家蠶的應(yīng)用中，造成這一現(xiàn)象的原因主要是在其它昆蟲缺乏有效的遺傳操作手段。
　　為了分析Wnt信號通路在家蠶中的生物學(xué)功能，建立了一套簡單高效的基因敲除體系，尤其是利用Cas9-sgRNA所誘導(dǎo)的基因突變來解析昆蟲胚胎形成過程中相關(guān)基因的功能。Wnt1基因是許多生物胚胎發(fā)育所必需的，并在多種昆蟲中均證實了該基因于胚胎發(fā)育過程

3、所發(fā)揮的重要作用。在家蠶胚胎發(fā)育期直接注射 Cas9 mRNA和BmWnt1特異的sgRNA獲得典型的Wnt-缺失表型，包括：注射過的卵大多數(shù)不能孵化；解剖后，觀察到胚胎存在體節(jié)發(fā)育和色素沉積缺陷；Wnt1敲除的表型存在劑量效應(yīng)。此外，靶向Wnt1基因的兩條sgRNA的同時切割產(chǎn)生大約18 Kb的大片段刪除。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析的結(jié)果表明：在BmWnt1基因敲除后，Hox基因的表達均產(chǎn)生下調(diào)。這一結(jié)果表明BmWnt1