家蠶生殖細胞發(fā)生與胚胎發(fā)育相關功能基因的蛋白質組研究.pdf

1、昆蟲的生殖和胚胎發(fā)育是生命科學很重要的命題。家蠶是一種重要的經(jīng)濟昆蟲和鱗翅目模式昆蟲。了解家蠶的生殖和胚胎發(fā)育，對人類提高家蠶經(jīng)濟價值，利用自然界有益昆蟲以及防治有害昆蟲具有重要的理論意義和實用價值。隨著家蠶基因組草圖和精細圖的完成，家蠶基因組研究進入后基因組時代，即以研究整個基因組的功能及生物學意義為目標。蛋白質組學是后基因組時代的研究熱點。蛋白質作為基因表達的產(chǎn)物，生命過程的直接執(zhí)行者，蛋白質組學成為基因功能注釋很重要的方法。本研究

2、用蛋白質組學方法研究了家蠶五齡期幼蟲性腺蛋白質組表達譜與家蠶性連鎖胚胎期致死突變體胚胎蛋白質組表達譜，通過生物信息學對鑒定蛋白的功能和調控路徑進行了分析，挖掘其在生殖細胞發(fā)生和胚胎發(fā)育中的作用。本研究主要的內容和結果如下:
　　 (1)用shotgun的策略研究了家蠶P50品種五齡第5天幼蟲精巢和卵巢組織的蛋白質組。分別以0.35％和0.49％的假陽性率(FDR)在精巢和卵巢中鑒定了285個和205個非冗余蛋白。通過對家蠶精巢和

3、卵巢的蛋白質組表達譜比較，在鑒定的蛋白里面，有92個是精巢和卵巢共表達的，其余194個和113個分別為精巢和卵巢特異表達的。發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白(Ribosomal proteins)是精巢和卵巢中鑒定最多的蛋白家族。核糖體是合成新蛋白的場所，暗示生殖細胞正在進行活躍的增殖和生長。根據(jù)多肽片段的光譜數(shù)目，Apolipophorin是精巢和卵巢中含量都較高的蛋白，暗示脂蛋白在精子和卵子發(fā)生過程中的重要作用。細胞視黃酸結合蛋白Cellularre

4、tinoic acid binding protein(CRABP)是家蠶精巢中豐度極高的蛋白。14-3-3epsilon protein是精巢中豐度較高的蛋白，暗示這些蛋白在精子形成過程中具有重要作用。發(fā)現(xiàn)多種30K蛋白家族成員在精巢中表達，暗示30K蛋白在家蠶精子形成過程中的作用。在卵巢中豐度較高的是微管蛋白(Tubulins)，暗示微管蛋白在家蠶卵子發(fā)生過程中具有重要功能。對果蠅卵子發(fā)生過程的研究已揭示微管蛋白是卵母細胞確定、（胚

5、胎發(fā)育）體軸建立以及運輸母性RNA和蛋白所必需的，我們推測在家蠶卵子發(fā)生過程中可能也起這些重要功能。
　　 (2)一些在果蠅生殖細胞發(fā)育過程中很關鍵的基因蛋白也在家蠶中鑒定到同源蛋白。比如精巢中的減數(shù)分裂阻滯基因ALY與VISMAY，在卵巢中的胚胎發(fā)育形態(tài)素定位蛋白Exuperantia和Squid蛋白，表明家蠶和果蠅在精子分化和卵子發(fā)生等關鍵過程具有生物的保守性。
　　 (3)對精巢和卵巢共表達及特異表達蛋白進行生物信

6、息學分析，揭示了家蠶精細胞和卵細胞形成相關的功能蛋白與生物學路徑?；虮倔w(gene ontology)注釋發(fā)現(xiàn)精巢和卵巢蛋白功能類沒有較大差異，只有較少的類比如營養(yǎng)儲存是卵巢特異的功能類。生物學路徑分析發(fā)現(xiàn)細胞凋亡（apoptosis）、細胞周期(cellcycle)、分化(differentiation)、胚胎發(fā)生(embryogenesis)、成熟(maturation)、形態(tài)發(fā)生(morphogenesis)和遷移(migrat

7、ion)都是在精巢和卵巢中較豐富的生物學過程，表明精子和卵子發(fā)生的一般過程具有相似性，而相似的過程中特異的蛋白造成了最終精子和卵子在形態(tài)和功能上的差異。通過KEGG pathway分析發(fā)現(xiàn)涉及能量產(chǎn)生路徑的蛋白在精巢中最豐富，這與精子需要動力的能量需求相一致。
　　 (4)對鑒定的精巢和卵巢部分蛋白進行了其基因在mRNA水平與蛋白水平相對表達量一致性的觀察，發(fā)現(xiàn)一些基因在mRNA和蛋白水平的不一致。比如，fibroinase(B

8、CP)和ALY在蛋白水平顯示為精巢特異的，但它們的mRNA豐度在卵巢中比精巢中高。MLEprotein(MLE)和cytochrome P4509G3(Cyp9g3)，在蛋白水平顯示是卵巢特異的，而在轉錄水平上，精巢中的表達豐度比在卵巢中要高。這些結果表明這些基因可能存在轉錄后調控。把我們蛋白鑒定的結果和基因芯片數(shù)據(jù)比較，發(fā)現(xiàn)很多蛋白基因都存在轉錄后調控現(xiàn)象，表明轉錄后調控在生殖細胞發(fā)生過程中是一個較普遍的現(xiàn)象。
　　 (5)對

9、鑒定的精巢和卵巢蛋白基因進行染色體定位，發(fā)現(xiàn)性染色體含有更多精巢特異的蛋白基因，并且這些蛋白對精子的功能是必需的。
　　 (6)以性連鎖平衡致死系自交系平2品種雌性胚胎為材料，用雙向電泳蛋白質組學方法研究了致死基因l2的致死作用機理。通過對致死時期前致死胚胎和存活胚胎間的雙向電泳蛋白質組表達譜比較，尋找在致死基因作用下蛋白質組表達的變化。致死時期的確定通過對致死胚胎特征性形態(tài)觀察確定。致死時期前存活胚胎和致死胚胎的區(qū)分通過用與致

10、死基因l2緊密連鎖的多態(tài)性SSR標記進行鑒別區(qū)分。最終存活胚胎和致死胚胎間11個差異表達的蛋白點通過MALDI-TOF/TOF被成功鑒定。在這些鑒定的蛋白中，只有一個點在致死胚胎中總是上調表達，該蛋白點被鑒定為熱激蛋白HSP20.4。推測小熱激蛋白HSP20.4可能是致死基因作用下應激而上調表達，小熱激蛋白主要起分子伴侶的作用，也有研究證明有些小熱激蛋白與膜相關，起保護膜的作用，暗示致死胚胎中可能存在異常蛋白或者膜的損傷。對其余10個下

11、調的蛋白進行GO功能分類注釋發(fā)現(xiàn)它們參與胚胎發(fā)育、核苷代謝、tRNA剪切、翻譯和蛋白折疊等功能。對這些下調蛋白進行生物學調控網(wǎng)絡分析，發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要參與紡錘體裝配和形態(tài)發(fā)生等生物學過程。根據(jù)這些結果，我們推測l2的表達一定程度上影響了胚胎發(fā)育過程中的有絲分裂和形態(tài)發(fā)生過程。
　　 本研究結果豐富了家蠶性腺蛋白質組及家蠶胚胎發(fā)育功能基因組的信息，為闡明一些與家蠶生殖細胞發(fā)生與分化，以及胚胎發(fā)育相關的功能基因提供了蛋白質組水平的信