鮑雜交育種及胚胎發(fā)育的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、鮑是我國重要養(yǎng)殖貝類,但近年來由于種質(zhì)退化及環(huán)境污染的加劇,鮑的養(yǎng)殖面臨著嚴(yán)重的病害威脅。雜交是目前水產(chǎn)生物育種中應(yīng)用廣泛、行之有效的育種途徑之一,以培育生長迅速、抗逆性強(qiáng)的鮑養(yǎng)殖新品種為主要目的。本研究運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)方法(雙向電泳、串聯(lián)質(zhì)譜、數(shù)據(jù)庫搜索),對西氏鮑(Haliotis gigantean)與皺紋盤鮑(Halioti discus hannai)種間雜交、雜色鮑(Haliotis diversicolor)群體間雜交以

2、及雜色鮑胚胎發(fā)育過程等的蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行了比較分析,目的是為雜交優(yōu)勢分子機(jī)理解析和雜交育種方法提供參考依據(jù)。主要結(jié)果如下:
　　 1.鮑種間雜交子代及其親本系譜的蛋白質(zhì)組分析在雜種優(yōu)勢的研究中,如何準(zhǔn)確地預(yù)測在子代的表型變化仍然是一個問題。用雙向電泳和質(zhì)譜(MALDI-TOF-TOF)技術(shù)比較了西氏鮑(G)、皺紋盤鮑(D)和它們正反交雜交后代(DG和GD)之間的蛋白表達(dá)圖譜,觀察到正反雜交后代和親本之間的足部肌肉中蛋白點(diǎn)的數(shù)量分別

3、是:DD平均為673±21個蛋白點(diǎn),GG平均為692±25.6,DG平均為679±16.2,GD平均為700±19。和肌肉中蛋白點(diǎn)的數(shù)量相比,鮑血淋巴蛋白點(diǎn)數(shù)量明顯降低,DD平均為310±2,GG平均為330±6,DG平均為322±4,GD平均為325±5。雙向電泳圖像比較和蛋白鑒定表明四種鮑肌肉蛋白點(diǎn)存在差異。不同的雙向電泳圖像顯示肌肉蛋白點(diǎn)雜種F1與親本存在鏡像關(guān)系。此外,發(fā)現(xiàn)DG和GD所示的差異點(diǎn)均來自它們親本的雙向電泳圖像。從足

4、部肌肉蛋白中,識別出136個蛋白,主要參與能量代謝和脅迫應(yīng)答等生理功能,在參與能量代謝的蛋白中,DD中的表達(dá)量普遍較高,雜交后代的表達(dá)量在兩親本的表達(dá)量之間,參與脅迫應(yīng)答的蛋白表達(dá)量在四種鮑間的表達(dá)模式不太一致。雙向電泳圖像比較和蛋白鑒定結(jié)果表明四種鮑間的肌肉蛋白的表達(dá)有明顯的不同。
　　 用雙向電泳和質(zhì)譜(MALDI-TOF-TOF)技術(shù)比較了西氏鮑(G)、皺紋盤鮑(D)以及它們雜交后代卵子之間的蛋白表達(dá)圖譜,卵的雙向電泳圖像

5、顯示的蛋白點(diǎn)數(shù)目較多,DD平均為915±19個點(diǎn),GG平均為935±16個點(diǎn),GD平均為923±13個點(diǎn)。系統(tǒng)聚類分析表明,DD和GG的距離最大,DD和GD先聚為一類。共鑒定出112個凝膠點(diǎn),其中有59個點(diǎn)與鮑蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫匹配(52.7％的識別率)。鑒別出的蛋白主要參與蛋白質(zhì)生物合成、肌肉收縮和調(diào)節(jié)、分子伴侶、電子載體、脂類代謝、脅迫反應(yīng)、核酸代謝、蛋白質(zhì)折疊、蛋白質(zhì)氨基酸的磷酸化、翻譯過程、能量代謝、信號蛋白、細(xì)胞增殖、分化、信號傳導(dǎo)

6、、氧化應(yīng)激、卵黃蛋白。參與能量代謝的蛋白,包括精氨酸激酶、烯醇酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶(triosephosphate isomerase)、果糖二磷酸醛縮酶(fructose-bisphosphate aldolase)、甘油醛-3-三磷酸脫氫酶(glyceraldehyde3-phosphate dehydrogenase)、異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase1(NADP+),soluble-like)、蘋果

7、酸酶的前體(malate dehydrogenase precursor)、線粒體ATP合酶、2-甲基檸檬酸脫水酶(2-methylcitrate dehydratase),其中表達(dá)模式DD>GD>GG幾乎覆蓋了所有蛋白質(zhì)種類,在DD中表達(dá)量最高,雜種后代表現(xiàn)出相加性。參與脅迫反應(yīng)的蛋白,在三個鮑的家族中的表達(dá)模式基本為DD>GD>GG。包括超氧化物歧化酶、過氧化還原酶6、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶。
　　 2.“東優(yōu)1號”雜色鮑及其

8、親本足部肌肉的蛋白質(zhì)組學(xué)分析
　　 采用雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù),對雜色鮑臺灣群體(TT)、日本群體(RR)和雜交子代“東優(yōu)1號(TR)”足部肌肉蛋白進(jìn)行了研究,經(jīng)過PDQuest8.0數(shù)據(jù)分析,日本群體平均為924±7個點(diǎn),臺灣群體平均為861±11個點(diǎn),雜交群體平均為882±9個點(diǎn)。聚類分析表明:RR和TR先聚為一類,然后再和TT聚為一類。共鑒別出46個蛋白點(diǎn),其中有15個點(diǎn)來自鮑的數(shù)據(jù)庫,識別率為33.6％。鑒別出的蛋白質(zhì)主要參

9、與肌肉的收縮和調(diào)節(jié)、能量代謝、脅迫應(yīng)答等。參與能量代謝的蛋白包括ATP合成酶β亞基、果糖-1,6-二磷酸醛縮酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、烯醇酶、精氨酸激酶、tauropine dehydrogenase。鑒別出參與能量代謝的有差異表達(dá)的蛋白,雜交后代表現(xiàn)出相加性和超顯性。鑒別出2個應(yīng)激蛋白,即熱激蛋白Hsp70和Cu/Zn-超氧化酶歧化酶。熱激蛋白Hsp70在三個鮑家族足部肌肉中的表達(dá)量是TR>RR>TT,雜交后代呈現(xiàn)超顯性。Cu/Zn-超氧化

10、酶歧化酶在三個鮑家族足部肌肉中的表達(dá)量是RR>TR>TT,雜交后代呈現(xiàn)相加性。
　　 3.雜色鮑三個地理群體足部肌肉蛋白質(zhì)的雙向電泳研究
　　 采用雙向電泳技術(shù),對雜色鮑臺灣群體(TT)、日本群體(RR)與越南群體(YY)足部肌肉蛋白進(jìn)行了研究,并利用質(zhì)譜和軟件對差異蛋白進(jìn)行了分析。經(jīng)PDQuest軟件分析,在pH4—7,分子量10～120kD之間,雜色鮑日本群體平均為922±21點(diǎn),臺灣群體平均為904±25.6個點(diǎn),

11、越南群體平均為936±16.2個點(diǎn),三個地理群體共有254個點(diǎn)存在差異表達(dá)。其中7個點(diǎn)為日本群體特有,2個點(diǎn)為臺灣群體特有,3個點(diǎn)為越南群體特有,另有85個點(diǎn)在表達(dá)量上存在兩倍以上差異。通過聚類分析,RR和YY的距離最大,TT和YY距離最小,先聚為一類,這和它們所處的地理位置相一致。選用基質(zhì)輔助激光解吸離子化-飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF)技術(shù)和數(shù)據(jù)庫檢索鑒定差異蛋白。從足部肌肉蛋白中,識別出30個蛋白,主要參與肌肉的收縮和調(diào)節(jié),能

12、量代謝和脅迫應(yīng)答等生理功能。越南群體中參與肌肉收縮和調(diào)節(jié)的蛋白的表達(dá)水平表達(dá)量較高,幾乎覆蓋了所有的肌肉收縮和調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)的種類。觀察到大約8個蛋白點(diǎn)屬于能量代謝,包括ATP合酶β亞基、果糖二磷酸醛縮酶、精氨酸激酶、烯醇化酶和磷酸丙糖異構(gòu)酶、tauropine dehydrogenase。這些蛋白在三個群體中表達(dá)量類型呈多樣化。參與脅迫反應(yīng)的熱激蛋白Hsp70在三個地理群體足部肌肉中的表達(dá)量是RR>YY>TT,Cu/Zn-超氧化酶歧化酶

13、在三個地理群體足部肌肉中的表達(dá)量是YY>RR>TT。
　　 4.雜色鮑胚胎發(fā)育蛋白質(zhì)表達(dá)
　　 盡管在基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究上,腹足類胚胎發(fā)育都具有潛在的用途,但對于胚胎發(fā)育的蛋白質(zhì)的表達(dá)卻知之甚少。首次從蛋白質(zhì)組的層面上對雜色鮑的胚胎發(fā)育進(jìn)行了分析,以了解蛋白質(zhì)在發(fā)育的關(guān)鍵階段中所扮演的角色,如殼的形成,鰓蓋和心臟的出現(xiàn),頭和足部的分化等。為了分析發(fā)育階段蛋白質(zhì)的表達(dá),使用2-DE檢測,質(zhì)譜分析,肽從頭測序的MS-BLAS

14、T,來識別蛋白。之所以采用跨物種的從頭鑒定法(de novo cross-species proteinidentification method)是因?yàn)檎麄€腹足類基因組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的缺乏。共鑒定出150個凝膠點(diǎn),其中有42個點(diǎn)與鮑蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫匹配(28％的識別率)。這些蛋白質(zhì)參與的功能主要體現(xiàn)在:殼的形成、能量代謝、信號傳遞、調(diào)控肌動蛋白、蛋白質(zhì)合成、折疊、細(xì)胞周期和細(xì)胞命運(yùn)的決定,為胚胎發(fā)育是一個動態(tài)的蛋白質(zhì)合成和代謝的過程提供證