斑馬魚生長抑素-1基因靶向敲降和營救以及基于表達(dá)譜的胚胎發(fā)育功能分析.pdf

1、SS1作為生長抑素(somatostatin-SS)基因家族的最原始基因，是由生長抑素前體(PPSS1)合成，在組織特異的蛋白酶作用下分裂產(chǎn)生的兩種生物活性多肽（SS—14和SS—28），分別在C端14位和28位一致，是存在所有脊椎動(dòng)物中常見的亞型。已有研究利用原位雜交技術(shù)確定了SS1在斑馬魚胚胎發(fā)育時(shí)期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和胰腺中表達(dá)。但是，對SS1在魚類早期胚胎發(fā)育中的功能還缺乏研究。本實(shí)驗(yàn)室利用人工合成的針對SS1 mRNA起

2、始密碼子附近區(qū)域的morpholino靶向反義核酸，顯微注射斑馬魚胚胎敲降SS1基因的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SS1的敲降顯著降低了斑馬魚的運(yùn)動(dòng)能力，而且使斑馬魚的個(gè)體發(fā)育受到阻滯，體外合成的SS1 mRNA可以部分回救morphant表型缺陷。為驗(yàn)證SS1基因表達(dá)下降是否影響其他基因的表達(dá)，進(jìn)一步探究SS1基因在胚胎發(fā)育時(shí)期的功能，本研究運(yùn)用靶向mRNA基因表達(dá)敲降(knockdown)、體外轉(zhuǎn)錄合成mRNA在體表達(dá)、受精卵顯微注射等發(fā)育遺傳學(xué)

3、技術(shù)，獲得SS1敲降、SS1營救斑馬魚胚胎，選取發(fā)育到30hpf時(shí)期的胚胎，利用第二代深度測序技術(shù)，以野生型胚胎作對照，分別對敲降、營救的胚胎進(jìn)行基因表達(dá)譜測序分析，篩選表達(dá)差異基因。本研究對解明SS1基因在斑馬魚胚胎發(fā)育時(shí)期的功能具有重要意義。
　　選取30hpf的胚胎提取總RNA，對SS1基因敲降、營救、野生型胚胎進(jìn)行表達(dá)譜分析，每組設(shè)兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)。對于每個(gè)處理組的兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)分別建庫并進(jìn)行Illumina高通量測序。每個(gè)

4、文庫產(chǎn)生大于11.77 M raw reads。經(jīng)過低質(zhì)量數(shù)據(jù)的過濾后，總共產(chǎn)生77763126條clean reads，其中每個(gè)樣品的clean reads數(shù)為11.66M～15.02M;每個(gè)文庫的GC含量也均相一致（約為47％）。各樣品與斑馬魚基因組map上的reads數(shù)為11 M～14.11 M之間，占總reads數(shù)的93.52％-94.3％，表明以NCBI斑馬魚基因組參考是合適的。zfSS1 MR組內(nèi)與zfWT組內(nèi)重復(fù)之間的皮爾

5、遜相關(guān)系數(shù)（Pearson's correlation coefficient）相近(R2=0.98，zfSS1M組的生物學(xué)重復(fù)之間的相關(guān)系數(shù)為(R2=0.973)，這些結(jié)果表明了技術(shù)重復(fù)和生物學(xué)重復(fù)的高度可重復(fù)性。zfSS1MR組與zfWT組具有相似的基因表達(dá)水平變化趨勢，而zfSS1M組的基因表達(dá)水平與這兩組相比則大幅變化，表現(xiàn)為上調(diào)和下調(diào)。對于有生物學(xué)重復(fù)的實(shí)驗(yàn)，由于DESeq已經(jīng)消除了生物學(xué)變異，則對差異基因篩選的標(biāo)準(zhǔn)一般只為:

6、padj＜0.05。zfSS1M組較zfWT相比有935個(gè)基因呈現(xiàn)顯著的差異表達(dá)，其中上調(diào)334，下調(diào)601。而zfSS1MR組較zfWT相比只有1個(gè)差異表達(dá)的基因，這說明營救組的胚胎基因表達(dá)與對照組近似。但值得注意的是zfSS1MR組較zfSS1M組相比有1086個(gè)基因差異表達(dá)顯著，其中上調(diào)691個(gè)基因，下調(diào)395個(gè)基因，說明營救組與敲降組的基因差異顯著的同時(shí)，又和敲降組與對照組間的差異基因有所區(qū)別。由此可見，營救的同時(shí)連帶影響了除敲

7、降帶來的差異表達(dá)之外的基因的差異表達(dá)。這需要篩選zfSS1M vszfWT的差異基因與zfSS1MR vszfSS1M的差異基因的交集，也就是敲降后的差異基因與營救后的差異基因的共同的基因，這部分共同的基因即營救成功的基因。zfSS1M vszfWT與zfSS1MR vszfSS1M有705個(gè)基因，說明zfSS1M組與zfWT的935個(gè)差異基因，有705個(gè)營救成功。
　　表達(dá)譜測序分析結(jié)果如下:
　　(1)SS1基因敲降后引

8、起胰島素誘導(dǎo)的蛋白家族（insig1），胰島素樣生長因子Ⅱb(igf2b)、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGF binding proteins)的表達(dá)顯著上調(diào)，經(jīng)過SS1 mRNA營救后這些基因恢復(fù)到與對照組無顯著差異的表達(dá)水平，與SS1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。GH/IGF軸及其信號(hào)成分是促進(jìn)動(dòng)物生長發(fā)育調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的中心。本研究結(jié)果顯示，SS1通過負(fù)調(diào)控作用，抑制GH/IGF軸的促生長作用。SS1敲降導(dǎo)致促甲狀腺素釋放素(trh)-基因表達(dá)明顯上調(diào)

9、，TRH主要促進(jìn)甲狀腺素的釋放，甲狀腺素主要促進(jìn)骨骼、腦和生殖器官的生長發(fā)育。甲狀腺激素又是是垂體分泌GH的主要調(diào)節(jié)因子，本研究結(jié)果表明，SS1還可以通過抑制trh的表達(dá)，間接調(diào)節(jié)GH的分泌。
　　(2)本實(shí)驗(yàn)SS1敲降后，胚胎表型表現(xiàn)為大腦分室模糊，發(fā)育不良，經(jīng)過表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Pou3f1顯著下調(diào)，經(jīng)過SS1 mRNA營救后恢復(fù)與對照組相當(dāng)?shù)谋磉_(dá)水平，Pou3f1轉(zhuǎn)錄因子引發(fā)外胚層一個(gè)區(qū)域的干細(xì)胞變成神經(jīng)前體細(xì)胞，從而生

10、成神經(jīng)外胚層。這些神經(jīng)前體細(xì)胞然后繼續(xù)分化形成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，然后最終形成大腦和神經(jīng)系統(tǒng)，提示SS1可能通過正調(diào)POUⅢ基因家族的表達(dá)在斑馬魚大腦和神經(jīng)系統(tǒng)形成時(shí)起作用。SS1敲降后導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子sox19a、sox19b、sox21b、sox12明顯下調(diào)，經(jīng)過SS1 mRNA營救后這些基因又恢復(fù)到與對照組相當(dāng)?shù)谋磉_(dá)水平。sox19a、sox19b這兩個(gè)SoxB1成員具有促使神經(jīng)元分化的功能。對于神經(jīng)發(fā)生的另一個(gè)要求是Sox21的誘

11、導(dǎo)，Sox21屬于SoxB2組并且極像SoxB1蛋白質(zhì)， Sox21可能通過競爭性結(jié)合共同的靶基因來阻礙SoxB1蛋白質(zhì)的抗神經(jīng)源性活性。從一個(gè)NEP細(xì)胞到一個(gè)成神經(jīng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變還由SoxC轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)，sox12作為SoxC轉(zhuǎn)錄因子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能中起到一定作用。SS1敲降后導(dǎo)致sox19a、sox19b、sox21b和sox12顯著下調(diào)，說明SS1與SOX轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)正相關(guān)，在神經(jīng)元分化中起到作用。
　　(3) SS1敲降后

12、導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子foxo3b顯著上調(diào)，SS1 mRNA營救后該基因恢復(fù)到與對照組相當(dāng)?shù)谋磉_(dá)水平。而FoxO作為Fox轉(zhuǎn)錄因子家族的亞家族能夠起到G1期阻滯、G2期延遲、DNA修復(fù)以及凋亡誘導(dǎo)的作用，還能抑制腫瘤細(xì)胞的增長。SS1敲降后導(dǎo)致胚胎發(fā)育缺陷，可能與Fox轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)，提示SS1與Fox轉(zhuǎn)錄因子共同維持胚胎發(fā)育、細(xì)胞周期進(jìn)程、凋亡誘導(dǎo)和新陳代謝。
　　綜上所述，在斑馬魚胚胎發(fā)育時(shí)期，SS1通過直接方式對GH/IGF軸進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)