磷酸化修飾對(duì)家蠶二分濃核病毒NS1蛋白活性的調(diào)控作用.pdf

1、1962年在日本伊娜首次發(fā)現(xiàn)家蠶二分濃核病毒（Bombyx mori bidensovirus，BmBDV），當(dāng)時(shí)將其命名為空頭性軟化病病毒，該病毒特異感染家蠶中腸柱狀細(xì)胞，在發(fā)病后期也可感染中腸杯狀細(xì)胞，致使家蠶罹患濃核癥，患病家蠶表現(xiàn)出下痢和空頭等癥狀。該病毒粒子外圍無(wú)囊膜包被，直徑約20-24 nm，呈正二十面體結(jié)構(gòu)，含有兩套基因組DNA(VD1和VD2)，分別包裝在各自病毒衣殼中，且病毒編碼自身DNA聚合酶。2012年，將該病毒

2、正式改名為家蠶二分濃核病毒。
　　BmBDV VD1-ORF2編碼一個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白NS1，該蛋白由361個(gè)氨基酸殘基組成，其理論分子量大小為36 kDa，等電點(diǎn)為8.70。本課題組前期研究證實(shí)NS1蛋白為一個(gè)多功能蛋白，具有ATPase、解旋酶以及綁定特定DNA序列的活性，在BmBDV的生活史中起著重要的作用。多序列比對(duì)結(jié)果表明，BmBDV NS1蛋白與細(xì)小病毒NS1蛋白同源，細(xì)小病毒NS1蛋白為多功能蛋白，其活性由磷酸化調(diào)控，參與

3、細(xì)小病毒基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。在本研究中，利用桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并純化BmBDV NS1蛋白，通過(guò)質(zhì)譜鑒定該蛋白的磷酸化修飾位點(diǎn);另外，定點(diǎn)突變磷酸化位點(diǎn)后，表達(dá)、純化三個(gè)突變型BmBDVNS1蛋白，測(cè)定其ATPase活性，將其與野生型NS1蛋白活性進(jìn)行比較，從而鑒定磷酸化修飾對(duì)BmBDV NS1蛋白活性的影響。
　　本文利用桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)在Sf-9細(xì)胞中表達(dá)NS1蛋白，對(duì)Sf-9細(xì)胞中表達(dá)的NS1蛋白進(jìn)行鑒定

4、，將NS1蛋白條帶摳出，并通過(guò)LC-MS/MS對(duì)其進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，質(zhì)譜結(jié)果表明NS1蛋白為磷酸化蛋白，其磷酸化修飾位點(diǎn)為BmBDV NS1序列中184位點(diǎn)的Thr殘基，而Thr-181和Thr-191為潛在的磷酸化修飾位點(diǎn)。為此，本文設(shè)計(jì)3對(duì)突變引物，將其三個(gè)蘇氨酸殘基所對(duì)應(yīng)的堿基:541-543，550-552，571-573 ACT突變?yōu)镚GT，測(cè)序分析成功構(gòu)建三個(gè)突變型ns1序列，將突變型和野生型ns1序列轉(zhuǎn)座至Ac-Bacmi

5、d上，構(gòu)建重組Ac-Bacmid，通過(guò)轉(zhuǎn)染Sf-9細(xì)胞獲得重組病毒，將重組病毒感染Sf-9懸浮細(xì)胞，在搖瓶中懸浮表達(dá)野生型和三個(gè)突變型NS1蛋白，收集感染后的懸浮細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行超聲破碎，利用鎳柱純化出野生型NS1蛋白和NS1蛋白突變體。經(jīng)SDS-PAGE和Westem blot對(duì)純化的靶蛋白進(jìn)行驗(yàn)證后，利用ATP酶活性連續(xù)反應(yīng)光譜法定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定純化后的NS1蛋白ATPase活性，其活性結(jié)果為:Thr184位點(diǎn)突變后，NS1-M2的

6、ATPase活性與wt-NS1活性相比，差異極顯著;Thr-191突變后，NS1-M3的的ATPase活性與wt-NS1活性相比，差異顯著;Thr-181突變后，NS1-M1的活性雖下降，與野生型NS1活性相比，沒(méi)有明顯差異;對(duì)野生型NS1蛋白進(jìn)行磷酸酶處理，使NS1去磷酸化，去磷酸化后的NS1蛋白活性也顯著低于野生型NS1活性?；钚越Y(jié)果表明NS1蛋白序列中184位蘇氨酸殘基存在磷酸化修飾，磷酸化修飾能顯著改變NS1蛋白的ATPase活

7、性，BmBDV NS1蛋白與病毒DNA復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄和病毒增殖等生化過(guò)程相關(guān)，進(jìn)而為了解該病毒增殖的分子機(jī)制和病毒防控提供了理論基礎(chǔ)。
　　家蠶核型多角體病毒上幾丁質(zhì)酶基因（chiA）和半胱氨酸蛋白酶基因（cp）的編碼產(chǎn)物與宿主死亡后液化相關(guān)，為病毒增殖非必需基因，敲除后可延長(zhǎng)病毒對(duì)家蠶的半數(shù)致死時(shí)間(Median lethal time，LT50)，從而延長(zhǎng)外源蛋白的表達(dá)時(shí)間。在本研究中，以缺失幾丁質(zhì)酶基因和半胱氨酸蛋白酶基因的

8、家蠶核型多角體病毒(△Bm-Bacmid)為載體，在家蠶體內(nèi)表達(dá)野生型和突變型BmBDV NS1蛋白，統(tǒng)計(jì)每天家蠶死亡頭數(shù)，測(cè)定各病毒對(duì)家蠶的半數(shù)致死時(shí)間，通過(guò)比較各半數(shù)致死時(shí)間的大小，從而判斷BmBDVNS1蛋白的磷酸化修飾作用對(duì)NS1蛋白毒力強(qiáng)弱的影響。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下:表達(dá)wt-NS1病毒的LT50比空△Bm-Bacmid的LT50短27.36 h;表達(dá)NS1-M1的病毒LT50比表達(dá)wt-NS1的病毒長(zhǎng)15.36 h;表達(dá)NS1-M