家蠶bystin基因的分子特征和表達(dá)分析.pdf

1、Bystin最早在HT-H細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，是與Trophinin和Tastin結(jié)合的一種胞質(zhì)蛋白。Trophinin是膜內(nèi)在蛋白，通過(guò)同親性結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞粘連，這種細(xì)胞粘連需要Bystin和Tastin兩種胞質(zhì)蛋白的參與。troplurun和tastin基因只在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，而bystin基因，在真核生物中是高度保守的。目前研究認(rèn)為bystin主要參與核糖體的生物發(fā)生、胚胎的植入與發(fā)育等生命活動(dòng)過(guò)程，但家蠶bystin的功能至今未有報(bào)道。<

2、br>　　 本試驗(yàn)從家蠶蛹cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增到家蠶bystin基因的完整開(kāi)放閱讀框(ORF)，將其命名為Bmbys(Bomby.mor.bystin)。該ORF序列長(zhǎng)128.bp，編碼427個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為49 kDa。我們將Bmbys基因克隆到原核表達(dá)載體pET-28a中，得到重組質(zhì)粒pET-28a-Bmbys，經(jīng)PCR、酶切和測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒是正確的。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，用終濃度為0.1m.IPTG低

3、溫誘導(dǎo)Bmbys蛋白的表達(dá)。得到的Bmbys蛋白以可溶性形式存在，故用超聲裂解菌體后離心所得的上清以親和層析的方法純化。以純化所得蛋白為抗原免疫雄性新西蘭兔，制備該蛋白的多克隆抗體，進(jìn)一步用ELISA檢測(cè)抗體的效價(jià)可達(dá)到1:10000以上。利用得到的抗體通過(guò)免疫化學(xué)方法檢測(cè)Bmbys蛋白在家蠶發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示在發(fā)育的蠶卵中Bmbys的表達(dá)具有動(dòng)態(tài)的組織特異性。Wester.blotting結(jié)果顯示在蠶卵發(fā)育的早期Bmbys

4、高表達(dá)，中期表達(dá)量較低或不表達(dá)，晚期表達(dá)量達(dá)到最高。不同發(fā)育階段蠶卵的免疫組化試驗(yàn)結(jié)果表明在蠶卵發(fā)育的早期Bmbys蛋白主要在卵黃細(xì)胞核和胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞中表達(dá)，發(fā)育的晚期Bmbys蛋白主要定位于馬氏管，而在發(fā)育中期未檢測(cè)到Bmbys的表達(dá)，與Wester.blotting結(jié)果一致。提取家蠶五齡幼蟲(chóng)各組織的總蛋白，用于Wester.blotting實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示Bmbys蛋白只在馬氏管中有表達(dá)，表明Bmbys可能與馬氏管的發(fā)育有關(guān)。此外，