家蠶和蜜蜂中Piwi蛋白基因的克隆與表達(dá)譜分析.pdf

1、Argonaute家族蛋白是小RNA介導(dǎo)的基因沉默復(fù)合體（RISC）中的核心蛋白，能夠結(jié)合小RNA以及剪切靶標(biāo)基因。其中Piwi亞家族是Argonaute蛋白家族的一個(gè)亞支，首先在生殖干細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)。2006年，多個(gè)實(shí)驗(yàn)室在哺乳動(dòng)物和果蠅中發(fā)現(xiàn)了與Piwi亞家族蛋白互作的小RNA（piRNA和rasiRNA）。此后，Piwi亞家族蛋白以RISC核心蛋白的身份重新登上研究舞臺(tái)。
　　 目前，對(duì)Piwi亞家族蛋白的了解仍十分有限，對(duì)

2、Piwi亞家族蛋白的研究局限于部分模式生物中，如大小鼠、人、斑馬魚(yú)及果蠅。除了果蠅之外，在龐大的昆蟲(chóng)物種中，對(duì)Piwi亞家族的了解幾乎為零。本論文主要研究了重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)（家蠶和蜜蜂）中Piwi亞家族蛋白的基因結(jié)構(gòu)特征及其表達(dá)譜，探討了Piwi亞家族蛋白對(duì)昆蟲(chóng)生殖發(fā)育的作用，為進(jìn)一步研究昆蟲(chóng)piRNA及其與Piwi亞家族蛋白互作奠定基礎(chǔ)。
　　 一、家蠶Piwi亞家族蛋白基因克隆與轉(zhuǎn)錄本分析
　　 利用家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)與

3、已知的Piwi亞家族蛋白，通過(guò)同源搜索，預(yù)測(cè)得到家蠶的兩個(gè)Piwi蛋白基因，命名為siwi1和siwi2。RT-PCR成功擴(kuò)增出家蠶兩個(gè)Piwi基因的部分編碼區(qū)，隨后進(jìn)一步利用RACE技術(shù)克隆得到了siwi1和siwi2的3’末端。利用EST數(shù)據(jù)庫(kù)和電子克隆方法，預(yù)測(cè)得到siwi1基因的部分5’UTR、完整的編碼區(qū)和部分3’UTR。RT-PCR成功驗(yàn)證了這個(gè)轉(zhuǎn)錄本的存在?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明，siwi1基因的編碼區(qū)含有18個(gè)外顯子和17個(gè)內(nèi)

4、含子，并且第3個(gè)內(nèi)含子是其中最長(zhǎng)的一個(gè)內(nèi)含子。保守結(jié)構(gòu)域分析表明，Siwi1蛋白含有Argonaute家族蛋白的特征結(jié)構(gòu)域：PAZ和PIWI結(jié)構(gòu)域，同時(shí)預(yù)測(cè)得到了3個(gè)保守的motif，而這三個(gè)motif都在PIWI結(jié)構(gòu)域中。進(jìn)化分析表明，Siwi1與果蠅Aub和Piwi相似性高，而Siwi2與果蠅Ago3在進(jìn)化上有著很高的相似性。
　　 二、家蠶Piwi亞家族蛋白表達(dá)譜分析
　　 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析家蠶Piwi亞

5、家族蛋白在不同發(fā)育階段和不同組織（頭，馬氏管、絲腺、消化道、精巢和卵巢）中的表達(dá)情況。數(shù)據(jù)分析表明，家蠶兩個(gè)Piwi亞家族基因在卵中表達(dá)量最高。發(fā)育至1齡初孵幼蟲(chóng)時(shí)，兩個(gè)Piwi基因的mRNA水平明顯下降，并且在幼蟲(chóng)階段維持在一個(gè)相對(duì)較低的水平，發(fā)育至4齡（siwi1）或者5齡（siwi2）幼蟲(chóng)時(shí)表達(dá)量達(dá)到最低。之后siwi1和siwi2的表達(dá)量快速上升，至蛹和成蟲(chóng)期達(dá)到一個(gè)較高水平。在六個(gè)不同組織中，siwi1和siwi2在精巢和卵巢

6、中高表達(dá)，而在馬氏管、絲腺、消化道中表達(dá)量明顯減弱。有意思的是，家蠶兩個(gè)Piwi亞家族蛋白在頭部的表達(dá)量都相對(duì)較高，siwi2基因在頭部的表達(dá)甚至略高于精巢和卵巢。
　　 三、蜜蜂Piwi亞家族蛋白基因克隆與轉(zhuǎn)錄本分析
　　 通過(guò)RT-PCR驗(yàn)證了預(yù)測(cè)的意大利蜜蜂Piwi基因轉(zhuǎn)錄本的存在（分別命名為Am-aub和Am-ago3）。通過(guò)RACE技術(shù)分別擴(kuò)增得到Am-aub和Am-ago3的5’和3’末端，并通過(guò)end-en

7、d PCR進(jìn)行了驗(yàn)證。同時(shí)還擴(kuò)增得到了多個(gè)Am-aub和Am-ago3基因的不同剪切轉(zhuǎn)錄本?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明，Am-aub基因共有7個(gè)外顯子，而Am-ago3基因有13個(gè)外顯子。保守結(jié)構(gòu)域分析表明，蜜蜂兩個(gè)Piwi亞家族蛋白都含有PAZ和PIM結(jié)構(gòu)域。在PAZ結(jié)構(gòu)域中預(yù)測(cè)到小RNA的結(jié)合位點(diǎn)，在PIWI結(jié)構(gòu)域中預(yù)測(cè)到小RNA的5’結(jié)合位點(diǎn)和剪切催化殘基三聯(lián)體DDH。進(jìn)化分析表明，Am-aub與家蠶Siwi1相似性最高，而Am-ago3與

8、果蠅Ago相似性最高。
　　 四、蜜蜂Piwi亞家族蛋白表達(dá)譜分析
　　 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了Am-aub和Am-ago3在不同蜂型（工蜂、蜂王和雄蜂）中的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)Piwi基因在雄蜂中的表達(dá)量都顯著高于工蜂和蜂王，而蜂王和工蜂的表達(dá)差異不顯著。分析Am-aub和Am-ago3在工蜂和蜂王中的變化發(fā)現(xiàn)，在蜂王的幼蟲(chóng)中，兩個(gè)Piwi基因表達(dá)量較低，蛹期后表達(dá)量迅速升高，化蛹后第2天達(dá)到最高點(diǎn)，隨后迅速下降。在