雞piRNAs的克隆、表達(dá)及體外抑制Piwi基因表達(dá)的研究.pdf

1、piRNAs（Piwi-interactingRNA）是主要富集不同種類動(dòng)物生殖系中的一類內(nèi)源性小分子RNA，Piwi基因主要存在于生殖細(xì)胞中，在生殖系干細(xì)胞的維持和精子發(fā)生方面發(fā)揮重要作用。生殖細(xì)胞中的piRNAs富集現(xiàn)象和導(dǎo)致雄性不育的Piwi突變體中piRNAs的大量減少暗示了piRNAs在配子發(fā)育和維持的過(guò)程中起重要作用。然而，對(duì)于piRNAs的結(jié)構(gòu)共性、起源、表達(dá)規(guī)律和功能以及與Piwi基因之間的作用機(jī)制一直不詳。本研究以雞為

2、模式動(dòng)物，獲得雞piRNAs序列并系統(tǒng)的探究piRNAs的遺傳特性和表達(dá)規(guī)律:通過(guò)構(gòu)建小RNAs的cDNA文庫(kù)和T-A克隆測(cè)序的方法從睪丸組織中獲得了19個(gè)大小為23～39nt的piRNAs序列;根據(jù)piRNAs的大小、同源序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)特征，選擇了3個(gè)不同序列并采用Real-TimeqPCR技術(shù)分析了中國(guó)地方雞種如皋黃雞和引進(jìn)隱性白羽雞的不同生命階段不同組織中piRNAs時(shí)空表達(dá)規(guī)律。同時(shí)以雞原始生殖細(xì)胞PGCs為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ筒⒉捎肦NA

3、i技術(shù)，通過(guò)建立Piwi-siRNAs轉(zhuǎn)染PGCs的方法并篩選出最佳沉默序列:采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染雞PGCs，運(yùn)用Real-TimeqPCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染24h、48h和72h后PGCs中Piwi基因、3個(gè)與生殖細(xì)胞形成和配子發(fā)生相關(guān)的調(diào)控因子(CVH、Dazl、CDH)以及3個(gè)調(diào)控干細(xì)胞多能性及自我更新的轉(zhuǎn)錄因子(PouV、Nanog、Sox2)的mRNA水平的相對(duì)表達(dá)量。為探討禽類piRNAs的遺

4、傳特性及發(fā)生和消失的機(jī)理提供基礎(chǔ)依據(jù)，也為禽類小分子RNA及其結(jié)合蛋白的深入研究和實(shí)際應(yīng)用積累基礎(chǔ)資料。結(jié)果表明:
　　 1.通過(guò)對(duì)雞piRNAs序列特征的研究發(fā)現(xiàn):編碼雞piRNAs基因序列在染色體和基因組中的分布特征同其它物種一樣，均具有不均勻性和基因間區(qū)偏愛(ài)性;二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)雞piRNAs具有與miRNAs不同的獨(dú)特的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。
　　 2.雞piRNAs多組織表達(dá)規(guī)律顯示:雞piRNAs不僅大量存在于生殖組織

5、，還大量存在于其它組織，表達(dá)規(guī)律因piRNAs種類、品種、性別的變化而不同，gga-piR-1在兩個(gè)品種的公、母雞的所有組織中的表達(dá)量均是相對(duì)最低，且到12周齡時(shí)均趨向一致的水平;而gga-piR-4表達(dá)量相對(duì)較高;gga-piR-5在如皋黃雞雄性中的全部組織中的表達(dá)量最高且在8周齡達(dá)到最高峰，在隱性白羽公雞中的表達(dá)量相對(duì)較高，而在如皋黃雞、隱性白羽母雞中均呈現(xiàn)中度表達(dá)水平。
　　 3.特異性siRNAs抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):相對(duì)于

6、陰性siRNA對(duì)照組，3組特異性siRNAs對(duì)雞Piwi表達(dá)在不同時(shí)間均有不同程度的抑制作用且抑制效果與siRNA序列相對(duì)于靶基因的位置和轉(zhuǎn)染時(shí)間長(zhǎng)短相關(guān)，24h后便可檢測(cè)出明顯抑制，48h達(dá)到高峰，72h后開(kāi)始減弱。在3個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)，空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，且3組特異性siRNAs與陰性對(duì)照組相比，均具有顯著性差異(P＜0.05)。對(duì)于3組特異性siRNAs進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)siR-3沉默效率最高。綜合以

7、上數(shù)據(jù)表明，轉(zhuǎn)染48h后的siR-3序列靶向抑制Piwi基因表達(dá)效率最高，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究。
　　 4.Real-TimeqPCR檢測(cè)CVH、Dazl、CDH及PouV、Nanog、Sox2的相對(duì)表達(dá)量顯示:與陰性對(duì)照組相比，抑制Piwi基因表達(dá)后，CVH、Dazl和Nanog基因表達(dá)量上升，而PouV和Sox2基因表達(dá)量下降且差異顯著（P＜0.05）。僅CDH基因表達(dá)量不變(P＜0.05)。結(jié)果表明，PGCs中Piwi基因