雞鈣代謝調節(jié)相關基因的克隆重組與表達研究.pdf

1、南京農(nóng)業(yè)大學博士學位論文雞鈣代謝調節(jié)相關基因的克隆重組與表達研究姓名：章世元申請學位級別：博士專業(yè)：動物遺傳育種與繁殖指導教師：楊利國20050601博士論文：雞鈣代謝調節(jié)相關基因的克隆重組與表達研究素氧基酸序列與鰻魚最接近，達到969％，其次是鮭魚，達937％。新?lián)P州雞甲狀旁腺激素的氨基酸序列與哺乳動物甲狀旁腺激素的氨基酸序列差異較大，與牛、人、鼠和豬甲狀旁腺激素的簧基酸序列的同源性分別為425％、354％、386％弄口449％。不同

2、動物種屬間D28k鈣結合蛋白的氨基酸序列的同源性均較高，新?lián)P州雞與蟾蜍的氨基酸序列較接近，同源性達到793％。2鈣代謝調節(jié)相關基因真核表達質粒的構建根據(jù)需要先后用本研究擴增得到的三個鈣代謝調節(jié)相關基因分別與pcDNA3和pCEP4等真核表達載體連接，進行了擴增基因真核表達質粒構建的研究。①對栽體和目的基因均采用BarnHI和HindlIJ對雞降鈣素基因與pcDNA3和pCEP4載體分別進行雙酶切、連接，構建真核表達質粒。⑦采用EcoRI

3、和BamHI對雞甲狀旁腺激素基因和peDNA3載體進行酶切和重組。在使用pCEP4載體時，對目的基因選擇EcoRI和BamHI兩種內切酶，而對載體則選擇了PvuⅡ內切酶，并對其切出的線性化目的基因片段再用Klenow酶補成平端，經(jīng)過如此處理后有利于提高真核表達質粒構建的效率。③用XhoI和BamHI對pCEP4載體和雞D28k鈣結合蛋白基因進行酶切，并構建重組質粒。④對上述構建的五個真核表達質粒經(jīng)過相應的酶切鑒定和PCR擴增均證明目的基

4、因已正確插入到表達載體中。3重組鈣代謝調節(jié)相關基因真核表達質粒的表達及其對鈣代謝的調節(jié)為了檢驗本研究構建的五個真核表達質粒的表達效力以及對蛋雞體內部分與鈣磷代謝有關的主要生化指標的影響，將構建的真核表達質粒與聚乙烯亞胺(PEI)混勻處理后，通過熒光檢測進行了重組pCEP4CaBP—D28k質粒導入COS一1細胞表達效果的評價。先后分三批次進行了重組基因真核表迭質粒在新?lián)P州保種雞體內表達效果的研究。試驗雞為450日齡、體重18O43kg，

5、每次均設對照組，注射相同拷貝數(shù)的真核表達載體。試驗組數(shù)隨每次注射質粒數(shù)而定，各組雞的數(shù)量均為10只。采集血樣及注射按試驗設計處理方案進行，分離得到血清后測定其中的降鈣素、甲狀旁腺激素、雌二醇、鈣和磷的濃度。D28k鈣結合蛋白真核表達質粒經(jīng)PEI處理后轉染COS1細胞。熒光檢測表明，本重組質?？稍贑OS一1細胞高效表達。新?lián)P州雞注射兩種重組降鈣素質粒后2、4乖6周，血清中降鈣素的平均值均顯著地高于對照組(P001)。注射兩個質粒后2、4、