家蠶SCPx-SCP2基因的克隆和表達(dá)分析.pdf

1、膽固醇是昆蟲細(xì)胞膜成分，同時(shí)，更主要的作用是作為蛻皮激素的前體。由于昆蟲體內(nèi)缺少2種關(guān)鍵性的合成酶，昆蟲不能通過自身從頭合成膽固醇。事實(shí)上，昆蟲主要依賴食物中的膽固醇來滿足生長(zhǎng)，發(fā)育和繁殖的需要。中腸是吸收轉(zhuǎn)化膽固醇的主要部位，然后通過血淋巴中的脂蛋白，運(yùn)送到前胸腺轉(zhuǎn)化利用；或是運(yùn)送到脂肪體以自由的膽固醇和膽固醇酯儲(chǔ)存起來。因而，昆蟲膽固醇代謝研究的重點(diǎn)集中在膽固醇代謝運(yùn)輸系統(tǒng)。 SCP2蛋白是動(dòng)物中廣泛存在的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。哺乳

2、動(dòng)物中SCPx/pro-SCP2基因是一個(gè)融合基因，其中SCP2蛋白的主要功能是參與膽固醇和脂肪酸的代謝，在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸膽固醇及脂類。SCP2能將細(xì)胞中的類固醇物質(zhì)運(yùn)載到線粒體，形成類固醇激素，如昆蟲的蛻皮激素；吸收自由的膽固醇形成細(xì)胞膜等。 本研究首先對(duì)家蠶SCPx/SCP2基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)了這個(gè)基因核酸、mRNA、和蛋白質(zhì)情況；利用RT-PCR，克隆了這個(gè)基因并調(diào)查該基因在不同組織、不同時(shí)期的表達(dá)情況；最后，通過p

3、ET表達(dá)系統(tǒng)將家蠶SCPx蛋白和SCP2蛋白進(jìn)行體外表達(dá)，為以后的功能研究奠定基礎(chǔ)。 以棉鈴蟲SCPx基因?yàn)閰⒄?，?jīng)過生物信息學(xué)分析，在家蠶基因組中找到了家蠶的SCPx/SCP2基因組序列，長(zhǎng)為8902bp?；诨蚪Y(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，推測(cè)家蠶SCPx/SCP2基因有2個(gè)編碼區(qū)1個(gè)內(nèi)含子。用DNAstar軟件將EST進(jìn)行拼接，結(jié)果得到2個(gè)contigs。將家蠶的BmSCPx/BmSCP2基因在cDNA水平進(jìn)行克隆、測(cè)序和分析，得到了家蠶B

4、mSCPx/SCP2的編碼區(qū)完整的序列。通過分析發(fā)現(xiàn)，該基因存在兩種拼接形式，即BmSCPx和BmSCP2兩種的mRNA形式。其中，BmSCPx長(zhǎng)2165nt，BmSCP2長(zhǎng)1035nt。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)BmSCPx/SCP2基因的確有選擇性拼接形式的存在，其中BmSCP2這種形式缺少了編碼硫解酶結(jié)構(gòu)域的區(qū)段的序列。 BmSCPx蛋白由536個(gè)氨基酸組成，BmSCP2蛋白由146個(gè)氨基酸組成。在線工具預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)BmSCPx蛋白

5、包含硫解酶-N,硫解酶-C和SCP2結(jié)構(gòu)域。BmSCP2蛋白只含有SCP2結(jié)構(gòu)域。BmSCPx和BmSCP2蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)分別是57.8kD、16.2kD和6.54、9.22。使用BLAST軟件分析發(fā)現(xiàn)，BmSCPx蛋白與棉鈴蟲SCPx蛋白有88﹪同源性和94﹪相似性。與果蠅SCPx蛋白有64﹪同源性和79﹪相似性。按蚊SCPx蛋白65﹪同源性和76﹪相似性。并且無(wú)論是BmSCPx蛋白，還是BmSCP2蛋白，在C端都有Ser-L

6、ys-Leu結(jié)構(gòu)過氧化酶體的靶序列，是一個(gè)高度保守的蛋白。 RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，BmSCPx/SCP2基因只在中腸和馬氏管以選擇性拼接的方式特異表達(dá)，其中，中腸的表達(dá)量要高很多。中腸時(shí)期表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)最早在4齡能檢測(cè)到兩種mRNA，整個(gè)5齡表達(dá)量都很高，在5齡3天達(dá)到最高峰，而在預(yù)化蛹時(shí)期卻只能檢測(cè)到BmSCP2，到成蟲期BmSCPx和BmSCP2都檢測(cè)不到。然而，BmSCP2的mRNA幾乎在所有組織都能檢測(cè)到。 另外

7、，本研究通過pET原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)BmSCPx和BmSCP2進(jìn)行提外表達(dá)。在IPTG的誘導(dǎo)下，在60kD處和約20kD處出現(xiàn)明顯濃粗的新蛋白質(zhì)帶。pET28(a)表達(dá)載體中His標(biāo)簽是2.39kD，而表達(dá)產(chǎn)物BmSCPx蛋白的分子量在57.85kD左右，BmSCP2蛋白的分子量在16.20kD左右。所以，與His的融合蛋白的分子量分別是：60.24kD和18.59kD。 SCP2蛋白是參與膽固醇在細(xì)胞內(nèi)各個(gè)細(xì)胞器間循環(huán)運(yùn)輸?shù)闹饕?/p>

8、白，對(duì)其基因結(jié)構(gòu)及蛋白功能的研究將有助于我們對(duì)昆蟲的膽固醇代謝有更為清楚的認(rèn)識(shí)。本研究采用生物信息學(xué)分析、基因克隆，表達(dá)譜分析等研究方法對(duì)家蠶的SCPx/SCP2基因進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了兩種不同的基因表達(dá)形式，它們?cè)诓煌瑫r(shí)期不同組織間存在表達(dá)差異，暗示著它們?cè)诖x過程中將起到不同的作用。此外，本研究通過體外表達(dá)的SCPx蛋白和SCP2蛋白也為SCP2抑制劑(SCPIs)的研究提供研究平臺(tái)，它可以為鱗翅目農(nóng)林害蟲的防治提供研究基礎(chǔ)，具有相當(dāng)